本文關(guān)鍵詞：液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在丹參成分分析中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在丹參成分分析中的應(yīng)用

王 洋1，陳 濤1，潘 霖2，李 正1，崔維利1，李 進(jìn)1*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193 2. 天津第一中心醫(yī)院，天津 300192

摘 要：丹參在中醫(yī)臨床中的應(yīng)用歷史悠久，其治療作用廣泛，特別是在治療心血管疾病時具有獨特的療效。丹酚酸及丹參酮類成分是丹參中的主要藥效成分，因其顯著的生物活性備受關(guān)注。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）是集分離與分析于一體的具有快速、高靈敏度特點的綜合分析方法，現(xiàn)已廣泛用于中藥成分分析中。通過對國內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)整理，對LC-MS技術(shù)在丹參有效成分分析中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，以期為科學(xué)闡釋丹參藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、提高質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、合理利用丹參藥材及含丹參中藥制劑提供參考。

關(guān)鍵詞：丹參；丹酚酸；丹參酮；液質(zhì)聯(lián)用；質(zhì)量控制

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0253 - 2670(2014)23 - 3494 - 09 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.23.025

Application of liquid chromatography coupled with mass spectrometry technique in component analysis of Salvia miltiorrhiza

WANG Yang1, CHEN Tao1, PAN Lin2, LI Zheng1, CUI Wei-li1, LI Jin1

1. First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 2. Tianjin First Center Hospital, Tianjin 300192, China

Abstract: Salvia miltiorrhiza (Danshen) is a kind of Chinese materia medica (CMM), and there has been a long history of Danshen for wide use in the treatment of numerous diseases, especially the unique therapeutic effect on cardiovascular disorders. Salvianolic acids and tanshinones are the main effective components in Danshen, which attracts the researchers’ more attention for its significant biological activity. Liquid chromatography coupled with mass spectrometry technique (LC-MS) is a rapid, sensitive, and comprehensive analytical method for the simultaneous separation and analysis, which has been widely used in the study on CMM component analysis. A large number of literatures of the application of LC-MS in the component analysis of Danshen are systematically summarized in this paper, so as to provide some indication for scientific interpretation of the effective material basis, and improve the quality control standard and comprehensive utilization of Danshen and its preparation.

Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge; salvianolic acids; tanshinones; liquid chromatography coupled with mass spectrometry technique; quality control

中藥是由多種化學(xué)成分所組成的復(fù)雜混合體系，并且中醫(yī)用藥經(jīng)常采用多種藥物配伍組成復(fù)方，這就給深入、系統(tǒng)的研究中藥成分帶來了巨大的挑戰(zhàn)。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛的功效[1]。近年來，丹參及含丹參收稿日期：2014-07-17

基金項目：天津市科技創(chuàng)新專項資金項目（06FZZDSH00408）；天津市西青區(qū)科技創(chuàng)新專項計劃項目（XQCXZX2012-006）；天津市西青區(qū)科

技型中小企業(yè)發(fā)展專項資金項目（XQKC2013-022）

作者簡介：王 洋（1981—），男，博士，主管藥師，研究方向為中藥體內(nèi)外藥物分析和中藥藥理學(xué)。

Tel: (022)83969680 E-mail: dayang810025@163.com

*通信作者 李 進(jìn) Tel: (022)83969822 E-mail: lijin@shitian.com

中藥制劑因為顯著的治療作用，特別是在心血管疾病治療領(lǐng)域，越來越為人們所關(guān)注[2]，眾多科學(xué)工作者從化學(xué)、藥理學(xué)、臨床應(yīng)用、安全性評價及質(zhì)量控制等方面對丹參進(jìn)行了大量的研究[3]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）集中體現(xiàn)了液相色譜（LC）高效的分離能力和質(zhì)譜（MS）強大的結(jié)構(gòu)鑒定能力，為

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混合物的快速、準(zhǔn)確分析提供了一種有效的手段，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于中藥化學(xué)成分分析[4]，MS對于中藥中已知物的快速定性及未知物的識別均具有極強的選擇性。電噴霧電離（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）為LC-MS最主要的2種離子源。LC-MS最常用的在線檢測器包括：三重四級桿（TQ或、傅里葉變換離子回MS/MS）、離子阱（IT或MSn）旋共振（FTICR）、飛行時間（TOF）等。其中，TQ主要用于定量分析，IT可以提供母離子和子離子之間的多極質(zhì)譜數(shù)據(jù)，F(xiàn)TICR及TOF可以提供高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)及化合物的元素組成[5]。此外還包括常與LC連接用于定量分析的紫外檢測器（UV或DAD）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）以及電化學(xué)檢測器（ED）等。近年來，基于現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的丹參及含丹參中藥制劑中有效成分的體內(nèi)外分析有了很大的進(jìn)展，主要方法包括LC、超高效液相色譜法（UPLC

HO

HO

COOH

HOHO

或UFLC）、薄層色譜（TLC）、氣相色譜（GC）、紅外光譜（IR）及LC-MS等。本文將對近年來國內(nèi)外有關(guān)采用LC-MS技術(shù)分析丹參有效成分的文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)的整理，對丹參有效成分分析的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。 1 體外成分分析 1.1 丹參有效成分分析

目前，已從丹參藥材中分離出70多種化合物，主要包括水溶性的酚酸類成分和脂溶性的二萜醌類成分（主要成分結(jié)構(gòu)信息見圖1），其中酚酸類成分是主要的活性成分[3]，對丹參藥材中酚酸類成分的分析都在負(fù)離子模式下進(jìn)行，并且多采用ESI的方式離子化[5]，而二萜醌類成分則采用正離子模式[6-11]。丹酚酸B和丹參酮IIA作為最主要的活性成分，常作為丹參藥材及含丹參中藥制劑質(zhì)量控制的標(biāo)志物[1]。

CHO

HO

O

咖啡酸

丹參素

HO

原兒茶醛

原兒茶酸

OH

隱丹參酮

HO

HOO

OHHO

丹酚酸A丹酚酸B

丹參酮 IIA

OH

HOHOHO

HOHO

丹酚酸C

丹酚酸D

二氫丹參酮 I

O

HOHO

HOHO

COOH

OH迷迭香酸

丹參酮 I

圖1 丹參中主要化學(xué)成分結(jié)構(gòu)

Fig. 1 Structures of main chemical constituents in S. miltiorrhiza

Zeng等[12]通過LC/ESI-MS/MS對丹參藥材中酚酸類成分進(jìn)行了分析。采用TQ作為檢測器，，發(fā)現(xiàn)咖啡酸及其同系物包含一個容易脫掉CO2的羧基，并確定了提取物中28種成分。宋敏等[13]通過LC建立了丹參脂溶性成分指紋圖譜，利用

LC-MS/MS對主要特征指紋峰進(jìn)行了分析，共鑒定出6個化合物。唐小巒等[14]通過LC-UV-MS/MS法分析丹參不同極性提取物，共鑒定出14個成分，并對其中的4個成分進(jìn)行了定量分析，為相關(guān)的譜-效學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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IT-MS屬于時間上的串聯(lián)質(zhì)譜，可以提供多級離子碎片，確定化合物的裂解規(guī)律，對于化合物的定性分析具有重要意義。Liu等[15]通過LC-IT-MS對丹參藥材的酚酸類成分進(jìn)行了定性分析，共鑒定42個酚酸類成分，其中16個為首次發(fā)現(xiàn)，說明IT比TQ更適合中藥有效成分的定性分析。沈建芳等[8]通過并建立了LC-IT-MS探討丹參酮IIA的質(zhì)譜裂解規(guī)律，丹參酮部位特征圖譜，對特征圖譜中11種主要化合物進(jìn)行了歸屬。董昕等[9]通過LC-IT-MS對丹參藥材中的水溶性及脂溶性成分進(jìn)行較為全面的質(zhì)譜行為考察，分別對8個丹參對照品進(jìn)行了多級質(zhì)譜裂解分析，并總結(jié)了丹參酚酸類和丹參酮類成分的裂解規(guī)律，根據(jù)裂解規(guī)律對藥材中的目標(biāo)成分進(jìn)行歸屬。趙新鋒等[16]利用超臨界萃取儀（SCFE）獲得丹參總提物，采用LC-IT-MS對總提物的化學(xué)成分進(jìn)行分析，確定了15種化學(xué)成分，其中2種為未知成分。韓鳳梅等[17]通過LC-IT-MS研究脂溶性丹參酮類成分的裂解規(guī)律，建立了脂溶性丹參酮類成分提取物的特征圖譜。脂溶性丹參酮類物質(zhì)具有相似的ESI-MS行為，裂解規(guī)律可用于鑒別丹參脂溶性化合物。

TOF也被有效地應(yīng)用于丹參酚酸類成分分析中，通過獲得的準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量及分子式數(shù)據(jù)庫，大量的化合物得到了確認(rèn)[18-19]。于文佳等[10]利用LC-TOF-MS對丹參脂溶性成分進(jìn)行了定性分析，共鑒定15個脂溶性成分。劉劼等[11]通過LC-TOF-MS研究二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA的分子結(jié)構(gòu)與MS裂解規(guī)律間的關(guān)系，并對丹參提取物中的脂溶性成分進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明4種化合物因為相似的結(jié)構(gòu)而具有相似的裂解規(guī)律，該規(guī)律被認(rèn)為是二萜醌類結(jié)構(gòu)的特征裂解規(guī)律。通過TOF提供的精確相對分子質(zhì)量，共鑒定出16個丹參酮類成分。Zhou等[20]通過LC-TOF-MS對丹參脂溶性成分進(jìn)行了分析，共鑒定出21個成分，并對其中的12個成分進(jìn)行了定量分析。Song等[21]采用主成分分析（PCA）與UPLC-UV-TOF-MS相結(jié)合的方法，對丹參進(jìn)行了質(zhì)量控制方面的研究。通過PCA技術(shù)篩選質(zhì)控標(biāo)志物，再通過TOF-MS對這些標(biāo)志物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性，結(jié)合抗氧化活性篩選，最終制定了與生物活性相關(guān)的丹參質(zhì)量控制方法。董倩倩等[22]建立靶細(xì)胞提取與LC/ESI-TOF-MS分析相結(jié)合進(jìn)行丹參活性成分研究的方法，對丹參中可能的活性成分進(jìn)行了推測。在不同細(xì)胞提取液中發(fā)現(xiàn)7個水溶性成

分。此外，還有一些研究通過單次進(jìn)樣同時分析了水溶性成分與脂溶性成分[23-25]。 1.2 含丹參中藥制劑成分分析

近年來在臨床中經(jīng)常使用的、療效確切的含丹參中藥制劑品種越來越多，主要包括復(fù)方丹參滴丸、丹參注射液、香丹注射液等，通過LC-MS技術(shù)可以對這些制劑的物質(zhì)組成、含量分布進(jìn)行系統(tǒng)研究。Zhang等[26]建立了丹參注射液的LC-MS指紋圖譜及代謝指紋圖譜，從注射液中鑒定出11種丹參酚酸類成分，體內(nèi)結(jié)果表明注射給藥后丹參素、丹酚酸B消除迅速，紫草酸、丹酚酸A/D消除緩慢，并且在注射給藥后30 min內(nèi)一直維持相對較高的血藥濃度，上述結(jié)果說明酚酸類成分可能是丹參注射液中最主要的生物活性成分。Liu等[23]建立了4種含丹參制劑（復(fù)方丹參片、丹參滴丸、丹參注射液、香丹注射液）的LC-MSn指紋圖譜，共鑒定水溶性及脂溶性成分34個。章弘揚等[27]采用LC-TOF-MS結(jié)合LC-MSn對復(fù)方丹參滴丸的化學(xué)組成進(jìn)行了分析，共鑒定出來自丹參的成分8個。韋英杰等[28]采用LC-MSn對復(fù)方丹參方的化學(xué)成分進(jìn)行分析，共鑒定來自丹參中的成分23個。馬曉紅等[29]通過LC-MSn從復(fù)方丹參片中鑒定出來自丹參的成分6個。胡興江等[30]通過LC-MS技術(shù)研究丹參與丹皮配伍的化學(xué)成分，鑒定并歸屬配伍煎液中19個成分，其中11個來自丹參，8個來自丹皮，配伍后丹參酚酸類、芍藥苷類成分的量高于單煎，而鞣質(zhì)的量降低。傅俊曾等[31]采用LC-MS/MS技術(shù)對芪參益氣滴丸中丹參有效成分丹參素、原兒茶醛進(jìn)行了定量分析，為該藥的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。 2 體內(nèi)成分分析

中藥多采用口服的方式給藥，機體對藥物的處置可分為吸收、分布、代謝及排泄4個相互關(guān)聯(lián)的過程，從血清藥理學(xué)的角度出發(fā)藥物口服后只有被血液吸收的成分才有可能成為真正的有效成分[32]。因此，通過LC-MS研究中藥有效成分的體內(nèi)過程對于明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及解釋和預(yù)測療效和毒副作用，制定合理的給藥方案是非常必要的。 2.1 丹參有效成分的體內(nèi)分析

對丹參有效成分的體內(nèi)研究主要集中在藥動學(xué)、組織分布、代謝等方面。丹酚酸B在體內(nèi)可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物[33-35]，通過LC-MS/MS技術(shù)可以對丹酚酸B及其代謝產(chǎn)物的藥動學(xué)特征進(jìn)行分析[34]。Xu等[35]通過LC-MSn分析了丹酚酸B口

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服給予正常/抗菌治療大鼠后，膽汁和尿液中的代謝產(chǎn)物。正常大鼠的膽汁中發(fā)現(xiàn)了4個代謝產(chǎn)物，糞便中有5個，并且在尿液中首次分離出2個新的代謝產(chǎn)物。而在抗菌治療大鼠的膽汁和尿液中沒有發(fā)現(xiàn)丹酚酸B的代謝產(chǎn)物，糞便中發(fā)現(xiàn)丹酚酸B的原型物。結(jié)果表明，腸道菌群在丹酚酸B的吸收、代謝和排泄過程中發(fā)揮著重要的作用。丹酚酸

B可能的體內(nèi)代謝途徑見圖2[35]。

隱丹參酮具有顯著的殺菌作用，其在體內(nèi)可以迅速地轉(zhuǎn)化為丹參酮IIA[36]，已有研究通過LC-MS/MS對二者的體內(nèi)藥動學(xué)過程進(jìn)行了分析[36-37]。Sun等[38]通過LC/ESI-DAD-MSn對丹參脂溶性提取物（TTE-50）及其在大鼠膽汁內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定性

分析，共鑒定16個丹參酮類化合物及17個I相代謝

H33

H33

圖2 丹酚酸B的體內(nèi)代謝過程

Fig. 2 In vivo metabolic pathways of salvianolic acid B

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產(chǎn)物。代謝物轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在丹參酮IIA C-4位側(cè)鏈，（PF2401-SF）口服給予大鼠后，丹參酮I、二氫丹參其中從甲基轉(zhuǎn)化為伯醇基再轉(zhuǎn)化為醛基為首次發(fā)現(xiàn)。Park等[39]通過LC-MS/MS對丹參標(biāo)準(zhǔn)提取物

酮I、丹參酮IIA和隱丹參酮的藥動學(xué)特征進(jìn)行了研究。丹參酮IIA可能的體內(nèi)代謝途徑見圖3[38]。

O

圖3 丹參酮ⅡA的體內(nèi)代謝過程

Fig. 3 In vivo metabolic pathways of tanshinone IIA

Sun等[40]采用LC-MS對丹酚酸A在比格犬體內(nèi)的藥動學(xué)特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明丹酚酸A口服后吸收迅速、并且具有較高的清除率及絕對生物利用度低的特點。Cui等[41]通過LC-MS/MS對紫草酸B的藥動學(xué)特征及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，在肝細(xì)胞培養(yǎng)液、血、尿及膽汁中均發(fā)現(xiàn)4個相同的代謝產(chǎn)物，鑒定結(jié)果表明甲基化作用是其代謝的主要路徑。裴渭靜等[42]通過LC-MSn對人血清中的丹參素及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其主要代謝產(chǎn)物為乙�；牡⑺�。通過LC-MS/MS對Beagle犬血漿中丹參素含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)口服或靜脈給予丹參素后血藥濃度的達(dá)峰時間均在1 h內(nèi)[43]。張群正等[44]采用LC-MSn對口服丹參滴丸后產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物丹參素異丙酯的吸收及組織分布進(jìn)行了系采用LC-MS/ 統(tǒng)分析。丁建剛等[45]以地西泮為內(nèi)標(biāo)，MS方法，建立Beagle犬血漿中丹參酮IIA的測定方法。

丹參中包含多種類型的化合物，單一成分并不能反映藥材的整體特征，因此多成分分析對于明確丹參藥材的作用特點具有重要的意義。林力等[46]采用LC-MS/MS方法建立了同時檢測Beagle犬血漿中丹酚酸D、丹酚酸B、紫草酸和迷迭香酸的分析方法，并對丹參提取物中4種化合物的藥動學(xué)特征進(jìn)行了分析。Li等[47]建立了一種同時測定人血清中6種水溶性成分的LC-MS/MS方法，該法可以用于丹參注

射液中該6種成分的藥動學(xué)研究。Liu等[48]給大鼠口服丹參提取物，通過LC-MS/MS技術(shù)建立了一種同時測定血漿中丹參水溶性成分（丹參素、迷迭香酸）與脂溶性成分（隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮I、二氫丹參酮I）的方法，并對6種成分的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行了計算，實現(xiàn)了2類成分的同時測定。 2.2 丹參制劑中有效成分的體內(nèi)分析

與化學(xué)藥物相比，中藥產(chǎn)品中含有大量的化學(xué)成分，特別是多種中藥配伍組成的復(fù)方，復(fù)方中多種藥物之間可以通過不同的配伍關(guān)系而發(fā)揮協(xié)同增效或減毒等作用。復(fù)方的治療作用與其中所含各種化學(xué)成分的協(xié)同作用密切相關(guān)。一種中藥成分具有藥物的屬性必須滿足以下3個條件：（1）廣泛的安全范圍；（2）適當(dāng)?shù)乃巹訉W(xué)性質(zhì)；（3）在藥材中有大量的分布。某些可以在血漿或者尿液等生物樣品中檢測出的中藥有效成分，具有適當(dāng)?shù)乃巹訉W(xué)性質(zhì)，可以用來證實中藥的系統(tǒng)暴露水平，就可以作為該種中藥的藥物代謝標(biāo)志物[49]，而合適的藥物代謝標(biāo)志物的選擇對于設(shè)計和解釋毒性及臨床療效，評估潛在的藥物之間相互作用具有重要意義[50]。

Li等[51]通過LC-MS/MS技術(shù)對丹參總酚酸鹽注射液中紫草酸B、迷迭香酸及紫草酸的藥動學(xué)、組織分布、代謝、排泄的過程進(jìn)行了系統(tǒng)分析。注射給藥后丹參總酚酸鹽快速而廣泛地分布于組織內(nèi)，而后被快速地消除和代謝。韋英杰等[28]對復(fù)方

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