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《南京中醫(yī)藥大學》 2014年

腸道菌群失調(diào)下的人參皂苷Rb_1代謝處置差異表征及機制研究

張圣潔  

【摘要】：人參(Panax ginseng C.A.Meyer)為五加科多年生草本植物人參的根,素有“百草之王”的美稱,是我國傳統(tǒng)名貴中藥。在中國、朝鮮、日本乃至亞洲國家被廣泛用于滋補保健和醫(yī)療�，F(xiàn)代藥理學研究表明人參具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗腦缺血、治療糖尿病、預防動脈粥樣硬化和抗炎等藥理學活性。人參的主要活性成分為人參皂苷,現(xiàn)已分離并確定結(jié)構(gòu)的單體皂苷成分有50余種。人參皂苷是由苷元和糖相連而成的糖苷類化合物,屬于三萜類皂苷。人參皂苷按照苷元的結(jié)構(gòu)不同分為3類：二醇型人參皂苷(PPD)、三醇型人參皂苷(PPT)和齊墩果酸型人參皂苷。PPD和PPT型人參皂苷都屬于達瑪烷型四環(huán)三萜類化合物,在人參皂苷中占大多數(shù),目前認為其是人參的主要活性成分之一。PPD型皂苷如人參皂苷Rb1、Rd、Rh2等,及PPT型皂苷如人參皂苷Re、Rg、Rg2等,其中人參皂苷Rb1、Rd、Re等含量較高,而人參皂苷Rg3、Compound K、Rh2、Rh3等含量極少,在人工栽培的人參中基本不存在,為稀有人參皂苷。 口服人參皂苷或人參提取物后,人參皂苷在酸性胃液環(huán)境下水解生成脫糖基代謝產(chǎn)物,在腸道中,亦可由腸道菌群所表達的糖苷水解酶(如p-葡萄糖苷酶,α-鼠李糖苷酶,木糖苷酶等)脫糖基,生成次級代謝產(chǎn)物或苷元,通過跨膜轉(zhuǎn)運等方式吸收進入體循環(huán),進而發(fā)揮藥效。各種人參皂苷間的差別主要在于苷元,糖基的數(shù)目、種類以及糖苷鍵的位置間的差異。中藥皂苷類成分的胃腸道代謝處置,已經(jīng)被證實是影響其吸收進而發(fā)揮藥效的重要節(jié)點；而腸道菌群所表達的糖苷水解酶系統(tǒng)則是該節(jié)點中介導皂苷類成分腸道代謝的關(guān)鍵因素。 腸道菌群是人體重要的“微生態(tài)器官”,作為與宿主共生的有生系統(tǒng),參與宿主多項生理過程。而腸道菌群紊亂逐漸被認為是某些代謝性疾病、精神類疾病的重要病理特征,且與此類疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腸道菌群紊亂常加劇疾病癥狀,疾病進程又可反作用于腸道菌群,加劇腸道菌群紊亂程度。此外,多種外界因素可影響腸道菌群的穩(wěn)態(tài)平衡,如應(yīng)激、抗生素濫用等,�？蓪е履c道菌群紊亂。對腸道菌群的組成和功能的系統(tǒng)表征是對腸道菌群進行相關(guān)研究的重要手段。 本課題對腸道菌群介導的人參皂苷脫糖基代謝進行了研究,以原人參二醇型的代表性成分人參皂苷Rb1作為模型藥物,研究腸道菌群失調(diào)能否影響其藥代動力學行為,若存在差異,其機制是否與腸道菌群的組成、數(shù)量和酶活性改變等因素有關(guān)。 本課題首次建立了UPLC-MS/MS同時測定人參皂苷Rb1及其脫糖基代謝產(chǎn)物的分析方法。給予大鼠口服80mg/kg的人參皂苷Rb1以及靜脈給藥8mg/kg,72小時內(nèi)測定人參皂菅Rb1及其脫糖基代謝產(chǎn)物的血藥濃度,結(jié)果顯示人參皂苷Rb1的絕對生物利用度僅為2.01%,且兩組大鼠體內(nèi)都能測到主要代謝產(chǎn)物人參皂苷Rd。此外口服給藥途徑還可以檢測到人參皂苷F2、C-K；靜脈給藥途徑則可以檢測到人參皂苷Rg3、Rh2。本實驗還將正常大鼠腸菌液與人參皂苷Rb1的進行體外溫孵,描繪人參皂苷Rb1及其脫糖基代謝產(chǎn)物的體外代謝曲線。 利用傳統(tǒng)誘導菌群失調(diào)的藥物林可霉素(5000mg/kg/day)造模一周,誘導大鼠菌群紊亂。藥代動力學行為考察結(jié)果顯示林可霉素組人參皂苷Rb1的AUC(0～∞)為(35568.85±11136.50)μg/L*h,而正常組的AUC(0～∞)為(42475.46±21962.66)μg/L*h,而人參皂苷Rd正常組血藥濃度明顯高于林可霉素組。實驗分別將兩組大鼠造模一周后新鮮糞便制備的菌液與Rb,進行體外溫孵,結(jié)果顯示正常組菌液Rd代謝生成速率明顯高于抗生素組。介導脫糖基反應(yīng)的p-D-葡萄糖苷酶活性考察結(jié)果表明隨著造模天數(shù)的增加兩組酶活差異逐漸增大,一周后正常組p-葡萄糖苷酶活性比林可霉素組酶活性高約1.89倍。 基于上述實驗研究結(jié)果,可以看出腸道菌群失調(diào)確實可以引起大鼠體內(nèi)外代謝行為差異。因此本課題選擇了由納他霉素、新霉素和短桿菌肽組成的混合抗生素和束縛性應(yīng)激兩種誘導大鼠腸道菌群紊亂的模型進行研究。藥代動力學研究結(jié)果顯示,應(yīng)激組人參皂苷Rb1的AUC(0-t)、AUC(0～∞)、Cmax值均低于正常組存在顯著性差異,而Vz、Clz值則高于正常組值同樣存在顯著性差異。而應(yīng)激組的人參皂苷Rd的AUC(O-t)、Cmax、T1/2均高于正常組,混合抗生素組由于檢測到的Rd濃度較低差異更大。 在排泄實驗中,尿排泄曲線大致與藥時曲線濃度趨勢一致,且只能描繪出人參皂苷Rb1與Rd的累積排泄曲線,Rb1的最大累積尿排泄率為(1.33±0.29)%000。糞排泄實驗中可以檢測到人參皂苷Rb1、Rd、F2、Rg3、C-K�？股亟MRd累積糞排泄量最高,而F2、Rg3和C-K糞排泄量最低,可以推測Rd之后的代謝途徑反應(yīng)受到抑制。應(yīng)激組的F2、C-K累積糞排泄量最高,推測該組Rd→F2→C-K代謝途徑反應(yīng)更易發(fā)生。三組Rb1的累積最大分排泄量差異不大范圍在(24.17±3.19)%-(25.60±3.88)%。 利用體外溫孵的手段孵育人參皂苷Rb1,觀察藥物體外溫孵代謝差異情況。另對代謝產(chǎn)物人參皂苷Rd、F2、C-K生成速率進行考察。綜合各組的代謝曲線以及代謝產(chǎn)物的生成速率結(jié)果,可以看出抗生素組的每個代謝途徑都受到影響,反應(yīng)極慢。束縛性應(yīng)激使代謝產(chǎn)物生成速率增大,可能刺激相關(guān)糖苷酶的表達,導致各成分代謝產(chǎn)生差異。 本課題還對造模后大鼠腸道菌群的p-葡萄糖苷酶和p-葡萄糖醛酸苷酶活性進行考察,結(jié)果顯示造模一周后應(yīng)激組大鼠的β-葡萄糖苷酶活性高于正常組。抗生素組兩種糖苷酶活性均為最低,并存在顯著性差異。根據(jù)結(jié)果推斷由β-葡萄糖苷酶作為重要的介導人參皂苷脫糖基反應(yīng)的酶影響藥物在腸道菌群的代謝進而其在腸道的吸收,而p-葡萄糖醛酸苷酶活性雖然受到影響,但有可能對人參皂苷Rb1及其代謝產(chǎn)物在腸道中代謝無明顯影響。 在測定腸黏膜屏障功能的評價指標短鏈脂肪酸含量的實驗中,結(jié)果表明六種主要的短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的濃度均在正常組大鼠的腸內(nèi)容物中高于應(yīng)激組,應(yīng)激組又明顯高于抗生素組,表明束縛性應(yīng)激和抗生素可導致腸道菌群及其功能發(fā)生顯著變化。 綜上,本課題系統(tǒng)研究了模型藥物人參皂苷Rb1在菌群失調(diào)大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為,并從腸道菌群相關(guān)糖苷酶活性及功能方面對其機制進行了初步探討,為糖苷類藥物在菌群失調(diào)大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律提供了共性研究思路。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R289
【目錄】：

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