本文關(guān)鍵詞：桑葉防治糖尿病的效應(yīng)成分群及其作用機制研究

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【摘要】：第一章文獻(xiàn)研究第一節(jié)較系統(tǒng)地總結(jié)和歸納了國內(nèi)外關(guān)于糖尿病發(fā)病機制、診斷方法和治療方案等研究方面取得的進(jìn)展,以期為糖尿病的深入認(rèn)識以及臨床治療提供科學(xué)參考。第二節(jié)采用計算機對中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫中關(guān)于治療消渴癥的方劑進(jìn)行檢索,應(yīng)用Excel2010軟件建立方劑數(shù)據(jù)庫,收錄每首組方中的單味藥從而進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用關(guān)聯(lián)規(guī)則方法對組方中藥對以及藥組的應(yīng)用特點進(jìn)行分析,從而探討治療消渴經(jīng)方的用藥規(guī)律與特點。第三節(jié)通過歸納與分析近年來國內(nèi)外學(xué)者在糖尿病發(fā)病機制的認(rèn)識、桑葉對其調(diào)節(jié)血糖的功效成分及其作用機制等方面取得的研究進(jìn)展,以期為桑葉調(diào)控血糖及防治糖尿病并發(fā)癥的作用機制深入研究提供指引,為桑葉資源的開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。第二章桑葉多組分提取物的制備研究第一節(jié)干燥桑葉稱重后,采用回流提取的方法,其工藝參數(shù)為：料液比1：40,溶劑為70%乙醇,提取時間45 mmin,提取2次,兩次提取液過濾合并,減壓濃縮至無醇味。選擇AB-8型號的大孔樹脂對粗提物進(jìn)行純化。桑葉提取物以2BV·h-1的流速上樣,采用70%的乙醇以3 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,濃縮并冷凍干燥,進(jìn)樣分析。黃酮類成分含量為0.1%,酚酸類成分含量為0.4%,純化后其含量分別為5.3%、10.8%。第二節(jié)干燥桑葉稱重后,采用料液比1：12,回流1 h的提取方法進(jìn)行提取,提取液采用80%醇沉24 h,上清液濃縮后在陽離子交換樹脂上樣,采用0.5mol·L-1的氨水以1.5 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫,分別收集pH7-9.4, pH9.4-10.5, pH 10.5-13的不同pH段的洗脫液,濃縮,冷凍干燥得純化的生物堿組分。DNJ主要集中在pH 7-9.4和pH 9.4-10.5兩段,含量分別達(dá)到19.9%和39.4%。第三節(jié)干燥桑葉采用水提醇沉的方法對多糖類成分進(jìn)行提取,得到桑葉粗多糖提取物。利用Sevage和AB-8大孔樹脂純化多糖,上柱溶液pH=8,用0.1 mg·mL-1的NaCl濃度以2mL·min-1的洗脫速度進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,冷凍干燥,得純化的桑葉多糖組分。其中多糖含量由0.69%提高為18.9%。第三章采用葡萄糖氧化酶法,以蔗糖為底物,采用a-葡萄糖苷酶抑制模型對桑葉多組分進(jìn)行評價；采用等效線法、周-特氏聯(lián)合指數(shù)法和等輻射分析法評價兩組分間的藥效相互作用及量效特點,為揭示桑葉降血糖的作用機理提供科學(xué)依據(jù)�；钚栽u價表明,桑葉黃酮、生物堿、多糖組分均具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其抑制率隨各組分濃度的增加而升高,3個組分中桑葉生物堿抑制活性最強。桑葉生物堿與桑葉黃酮配伍、桑葉生物堿與桑葉多糖配伍均表現(xiàn)出協(xié)同增效作用,但桑葉多糖與桑葉黃酮組配伍未見明顯的協(xié)同作用。第四章采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對桑葉治療糖尿病的8種活性成分的分子作用機制進(jìn)行分析,揭示其多成分-多靶點-多通路的作用特點及相關(guān)關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)分析表明,桑葉中8種活性成分共涉及47個靶點,63條通路。這些通路與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等相關(guān),其中包括與糖尿病關(guān)聯(lián)的胰島素、MAPK、VEGF、Wnt、Jak-STAT等多條信號通路。第五章采用雄性SD大鼠灌胃桑葉生物堿、黃酮提取物,在不同時間點采集血漿樣品,處理后進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,槲皮素和山柰酚灌胃0.333 h后達(dá)到峰值,說明大鼠口服桑葉黃酮組分后吸收和分布迅速。服藥后4h左右,兩者第二次達(dá)到峰濃度,說明其在腸道內(nèi)的停留時間較長,可能原因為體內(nèi)存在肝腸循環(huán)。DNJ和Fagomine在胃腸道能較快地吸收入血,血藥濃度在0.667h達(dá)到峰值,說明兩者進(jìn)入大鼠體循環(huán)后快速分布,發(fā)揮藥效迅速。第六章采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計學(xué)分析,利用代謝組學(xué)的研究方法和技術(shù)探討糖尿病模型小鼠血漿和尿液的整體代謝物譜特征、代謝輪廓變化和生物標(biāo)志物群,并對桑葉生物堿、黃酮、多糖提取物干預(yù)后的生物效應(yīng)轉(zhuǎn)歸與分子機制進(jìn)行研究。結(jié)果表明,5組小鼠的血漿和尿液代謝物譜都得到了很好的區(qū)分,發(fā)現(xiàn)并鑒定了血漿中17個以及尿液中21個潛在生物標(biāo)志物,血漿中生物標(biāo)志物主要與纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸降解、色氨酸代謝和甘油磷脂代謝相關(guān),尿液中生物標(biāo)志物主要與苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、煙堿和煙酸鹽代謝、組氨酸代謝和鞘脂類代謝通路相關(guān)。這些代謝通路在糖尿病小鼠體內(nèi)發(fā)生紊亂,而給予桑葉黃酮、多糖、生物堿組分后可使之逆轉(zhuǎn)并向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸。第七章第一節(jié)采用腸道L細(xì)胞株GLUTag細(xì)胞為研究對象,研究AGEs對其細(xì)胞損傷、凋亡及炎癥損傷的影響,在此基礎(chǔ)上研究桑葉生物堿類、黃酮類、多糖類提取物以及單體DNJ和異槲皮苷干預(yù)后相應(yīng)指標(biāo)的變化,從而探討其調(diào)節(jié)糖尿病的分子機制。結(jié)果顯不,AGEs與RAGE結(jié)合后,可通過激活caspase-3、-9、誘導(dǎo)p53/Bax通路誘導(dǎo)腸道L細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時激活NF-κB因子表達(dá),釋放TNF-a、IL-1、IL-6,從而使腸道L細(xì)胞產(chǎn)生炎癥損傷。給予桑葉多組分后,各指標(biāo)均向正常組回調(diào),從而改善腸道L細(xì)胞炎癥損傷,阻止細(xì)胞凋亡。第二節(jié)采用HepG2細(xì)胞為研究對象,優(yōu)化胰島素的作用濃度和作用時間,最終建立HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型的最佳造模方法,在此基礎(chǔ)上觀察桑葉多組分對造模后的HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收的影響。結(jié)果表明,胰島素以3μg·mL-1作用48 h誘發(fā)的胰島素抵抗效果最佳。桑葉生物堿、黃酮、多糖三個提取物和DNJ、異槲皮苷單體可以明顯增加胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗,桑葉生物堿、黃酮、多糖三個提取物和DNJ、異槲皮苷單體處理后再用胰島素造模與造模同時給藥的HepG2細(xì)胞,葡萄糖吸收與正常水平?jīng)]有顯著差異,提示桑葉多組分可在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮作用。第三節(jié)采用前脂肪細(xì)胞株3T3-L1為研究對象,觀察高糖誘導(dǎo)后對細(xì)胞分化、葡萄糖攝取、脂肪細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)的影響,在此基礎(chǔ)上研究桑葉生物堿類、黃酮類、多糖類提取物以及單體DNJ和異槲皮苷干預(yù)后相應(yīng)指標(biāo)的變化,從而探討其調(diào)節(jié)糖尿病糖脂代謝的分子機制。結(jié)果顯示,桑葉生物堿、黃酮、多糖組分及DNJ、異槲皮苷單體在低濃度時可促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖,同時均可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵因子PPARγ、C/EBPα、 SREBP-1的表達(dá),從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化和葡萄糖攝取、轉(zhuǎn)運,提高脂肪細(xì)胞胰島素敏感性,繼而改善胰島素抵抗。第四節(jié)采用腎小管上皮細(xì)胞株HK-2為研究對象,觀察高糖誘導(dǎo)后對其ROS、NADPH氧化酶、ERK1/2水平的影響,在此基礎(chǔ)上研究桑葉生物堿類、黃酮類、多糖類提取物以及單體DNJ和異槲皮苷干預(yù)后相應(yīng)指標(biāo)的變化,從而探討其調(diào)節(jié)糖尿病腎病的分子機制。結(jié)果顯示,高糖可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的可增加HK-2細(xì)胞中的NOX1、NOX2、NOX4的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞EMT。給予桑葉多組分后,各指標(biāo)均向正常組回歸,表明桑葉多組分可通過調(diào)節(jié)NADPH氧化酶來減少ROS的產(chǎn)生,阻止HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
【關(guān)鍵詞】：桑葉 糖尿病 功效成分群 降血糖作用 分子機制
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R259
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-16
• 第一章 文獻(xiàn)研究16-38
• 第一節(jié) 糖尿病的研究現(xiàn)狀16-23
• 第二節(jié) 中醫(yī)藥治療消渴癥的用藥規(guī)律與特點23-30
• 第三節(jié) 桑葉防治糖尿病的效應(yīng)成分群及其作用機制研究30-34
• 參考文獻(xiàn)34-38
• 第二章 桑葉多組分提取物的制備研究38-50
• 第一節(jié) 桑葉中黃酮類與酚酸類成分的提取制備研究38-43
• 第二節(jié) 桑葉生物堿類成分的提取制備研究43-48
• 第三節(jié) 桑葉多糖類成分的提取制備研究48-49
• 參考文獻(xiàn)49-50
• 第三章 基于α-糖苷酶抑制活性的桑葉多組分藥效相互作用研究50-58
• 1 材料與方法50-52
• 2 桑葉不同組分及配伍組合對酶-抑制劑模型中α-葡萄糖苷酶抑制作用結(jié)果52-55
• 3 討論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 第四章 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的桑葉多組分對糖尿病調(diào)節(jié)作用的分子機制探討58-66
• 1 方法58-59
• 2 結(jié)果59-63
• 3 討論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-66
• 第五章 桑葉黃酮類、生物堿類成分的體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究66-76
• 1 材料66
• 2 方法66-68
• 3 結(jié)果68-74
• 4 討論74
• 參考文獻(xiàn)74-76
• 第六章 基于代謝組學(xué)的桑葉多組分對糖尿病小鼠的整體調(diào)節(jié)作用76-88
• 1 材料與方法76-77
• 2 實驗結(jié)果77-86
• 3 討論86
• 參考文獻(xiàn)86-88
• 第七章 桑葉多組分治療糖尿病及其并發(fā)癥的分子機制研究88-126
• 第一節(jié) 基于GLUTag細(xì)胞的桑葉多組分對糖尿病的作用機制研究88-99
• 第二節(jié) 基于HepG2細(xì)胞的桑葉多組分對糖尿病的作用機制研究99-106
• 第三節(jié) 基于3T3-L1細(xì)胞的桑葉多組分對糖尿病的作用機制研究106-116
• 第四節(jié) 基于HK-2細(xì)胞的桑葉多組分對糖尿病腎病的作用機制研究116-122
• 參考文獻(xiàn)122-126
• 結(jié)語126-128
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果128-129
• 致謝129

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