目的:本實(shí)驗(yàn)采用三硝基苯磺酸(TNBS)對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌腸造模,成功制備克羅恩病(CD,Crohn's disease)模型后,觀(guān)察針刺與艾灸對(duì)CD大鼠腸道菌群變化的調(diào)節(jié)。對(duì)腸道菌群Alpha多樣性、門(mén)水平菌群的結(jié)構(gòu)組成、科水平中特定差異性物種進(jìn)行對(duì)比分析。探討針刺與艾灸對(duì)CD的治療與腸道菌群發(fā)生的關(guān)系,為針灸臨床防治CD提供有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:選用隨機(jī)分組的方法將32只SD大鼠分為四組,分別為HE(空白組)、HA(模型組)、HB(針刺組)、HC(艾灸組),參照Morris2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)方法制備CD腸纖維化大鼠模型。造模成功后,對(duì)針刺組、艾灸組大鼠進(jìn)行干預(yù),操作穴位選取“天樞穴”、“上巨虛穴”,每日治療1次,每次治療15分鐘,共治療7天�？瞻捉M與模型組采用相同的方法固定15分鐘,但不做針刺與艾灸等其他治療。實(shí)驗(yàn)期間記錄大鼠的體重、糞便性狀、便血情況、大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的計(jì)算,治療結(jié)束后,對(duì)大鼠糞便進(jìn)行采集,運(yùn)用16S rDNA高通量測(cè)序方法對(duì)32例大鼠腸道微生物樣本進(jìn)行分析。收集大鼠結(jié)腸標(biāo)本,肉眼及生物顯微鏡下觀(guān)察四組大鼠的結(jié)腸病理變化。結(jié)果:1通過(guò)TNBS誘導(dǎo)大鼠,CD造模成功后,CD模型大鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯、懶動(dòng)、體重下降、厭食等情況,可見(jiàn)松散便、稀便及血便,DAI評(píng)分明顯增高,通過(guò)針刺與艾灸治療后,大鼠體重較模型組增加,糞便性狀,便血等情況較模型組改善,DAI評(píng)分顯著下降(P﹤0.01)。2肉眼觀(guān)察大鼠結(jié)腸形態(tài):空白組大鼠結(jié)腸形態(tài)正常,腸粘膜無(wú)充血水腫,質(zhì)軟,顏色淡紅,腸壁較薄,為正常的組織。模型組大鼠腸壁形態(tài)不規(guī)則,腸粘膜附著對(duì)側(cè)粘膜形成潰瘍,充血水腫,腸壁黏連,腸壁增厚,可見(jiàn)糜爛、出血及潰瘍,腸粘膜高度水腫,成塊狀增厚,如息肉狀。針刺、艾灸治療后結(jié)腸形態(tài)較模型恢復(fù),粘膜較模型光滑,局部充血、水腫等現(xiàn)象明顯減輕,腸壁變薄,未見(jiàn)明顯潰瘍糜爛面。3生物顯微鏡下觀(guān)察四組大鼠結(jié)腸病理變化:與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織層次模糊,結(jié)構(gòu)混亂,腸粘膜充血水腫,結(jié)腸腺體彎曲變形,杯狀細(xì)胞壞死脫落,隱窩畸形并有腸壁全層出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),呈透壁性炎癥反應(yīng),粘膜肌層增厚。經(jīng)針刺與艾灸治療后,腸粘膜結(jié)構(gòu)較完整,腸組織層次較清晰,結(jié)腸腺體結(jié)構(gòu)恢復(fù),腸粘膜肌層增厚改善,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、充血水腫現(xiàn)象較模型組明顯改善。4腸道菌群16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果:多樣性分析:CD模型組大鼠較空白組腸道菌群多樣性及豐度減少,而針刺與艾灸治療后,腸道菌群的多樣性及豐度恢復(fù)(P﹤0.05或P﹤0.01)。稀釋性曲線(xiàn)分析:以Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指數(shù)構(gòu)建的稀釋曲線(xiàn)結(jié)果表明:隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加,OTU水平下的Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指數(shù)增加,當(dāng)測(cè)序數(shù)據(jù)量達(dá)到一定的數(shù)值后,豐度及多樣性指數(shù)減小,曲線(xiàn)趨于平坦。群落組成與顯著性差異分析:在門(mén)水平對(duì)群落進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),模型組大鼠厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)減少,而變形菌門(mén)增加,通過(guò)針刺與艾灸治療后,擬桿菌門(mén)明顯上升,變形菌門(mén)明顯下降。在科水平進(jìn)行物種差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)腸桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌均存在顯著差異,主要表現(xiàn)為模型組大鼠腸桿菌顯著上升(P﹤0.01),而擬桿菌與乳酸桿菌顯著下降(P﹤0.01),針刺與艾灸治療后,腸桿菌明顯降低(P﹤0.01),擬桿菌與乳酸桿菌升高,艾灸升高顯著(P﹤0.05)。結(jié)論:1針灸能改善TNBS誘導(dǎo)的CD模型大鼠的一般狀況、DAI評(píng)分及病理變化。2針灸對(duì)腸道菌群的失調(diào)具有良好的調(diào)節(jié)作用,其中擬桿菌、腸桿菌以及乳酸桿菌可能為針灸治療CD的關(guān)鍵細(xì)菌。
【學(xué)位單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R245
【部分圖文】：

圖 1. 測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程圖 提取與質(zhì)檢步驟劑盒抽提糞便樣本的基因組 DNA，用 1.5%的瓊純度、完整性進(jìn)行檢測(cè)。 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)（熒光定量）好、覆蓋率較高 341F 和 806R 引物對(duì) 16SV3-V物對(duì) 16SV4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，合成帶有 barcode 序列增；電泳檢測(cè)，DNA 回收純化，熒光定量，進(jìn)表 1.3 PCR 引物引物名稱(chēng) 引物序列 341F 5’- CCTACGGGNBGCASCAG806R 5’- GGACTACNVGGGTWTCTA

圖 2 四組大鼠體重比較1.2 大鼠 DAI 評(píng)分DAI 評(píng)分結(jié)果顯示：造模結(jié)束后，針刺與艾灸組的 DAI 評(píng)分與模型組接近，表明三組無(wú)明顯差異（P>0.05），治療后，針刺與艾灸治療組的 DAI 評(píng)分明顯降低（P﹤0.01）。 說(shuō)明針刺與艾灸治療能減輕模型組大鼠的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)克羅恩病的恢復(fù)（如表 2.1、圖 2.1）。表 2.1 針灸治療前后大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（DAI）（Mean±SD）組別 造模后 治療后空白組模型組 2.33±1.01 2.21±0.78針刺組 2.29±0.98 0.96±0.88**艾灸組 2.25±0.83 1.08±0.92**注：與模型組比較，**P﹤0.01

圖 2.1 大鼠 DAI 評(píng)分指數(shù)對(duì)比2 病理組織學(xué)改變2.1 各組大鼠結(jié)腸形態(tài)肉眼觀(guān)察肉眼觀(guān)察大鼠結(jié)腸形態(tài)，空白組大鼠結(jié)腸形態(tài)正常，腸粘膜無(wú)充血水腫，質(zhì)軟，顏色淡紅，腸壁較薄，為正常的組織。模型組大鼠腸壁形態(tài)不規(guī)則，腸粘膜附著對(duì)側(cè)粘膜形成潰瘍，充血紅腫，腸壁黏連，腸壁增厚，可見(jiàn)糜爛、出血，腸粘膜高度水腫，成塊狀增厚，如息肉狀（見(jiàn)圖中箭頭所示）。針刺、艾灸治療后結(jié)腸形態(tài)較模型恢復(fù)，粘膜較模型光滑，局部充血、水腫等現(xiàn)象明顯減輕，腸壁變薄，未見(jiàn)明顯潰瘍糜爛面。見(jiàn)圖 2.2。
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本文編號(hào)：2853965