【摘要】：1目的通過臨床隊列研究、數(shù)據(jù)挖掘研究及體外實驗三部分觀察安徽省中醫(yī)院風(fēng)濕科治療強直性脊柱炎(AS)的藥物、血小板參數(shù)的變化、炎癥免疫反應(yīng)及新風(fēng)膠囊(XFC)改善血小板參數(shù)、炎癥免疫指標(biāo),并探討XFC通過SDF-1/CXCR4-VEGFA通路改善血小板活化及炎癥反應(yīng)的機制。2方法2.1臨床隊列研究電話隨訪2012年1月-2016年6月本院AS住院患者,出院后服用中成藥和中藥湯劑的時間及種類,錄入數(shù)據(jù)。根據(jù)服藥時間,定義暴露組。調(diào)取AS患者方藥應(yīng)用數(shù)據(jù),統(tǒng)計口服中成藥、中藥湯劑的使用情況,及各暴露組終點事件發(fā)生情況,采用卡方檢驗、多元回歸分析各因素與終點事件發(fā)生的關(guān)系。2.2數(shù)據(jù)挖掘研究從安徽省中醫(yī)院臨床數(shù)據(jù)中心,調(diào)取2012年6月-2017年7月安徽省中醫(yī)院風(fēng)濕科治療有效住院的AS患者的電子病歷資料共1110例。采集住院病人的一般情況,前20味中藥及新風(fēng)膠囊使用情況,血小板參數(shù)及免疫炎癥指標(biāo)等。依據(jù)是否合并使用XFC,將患者分為健脾(中藥+XFC+芙蓉膏)組和單純(中藥)組。采用SPSS 21.0、SPSS Clementine 11.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。2.3體外實驗研究2.3.1 XFC含藥血清的制備將35只雄性SD大鼠,隨機分為空白對照組、陰性對照組、高、中、低劑量(按照20倍,10倍,5倍XFC臨床給藥劑量區(qū)分)組。連續(xù)灌胃3天后,取血除菌備用。MTT實驗檢測最佳XFC劑量。2.3.2臨床AS患者及健康者單核細(xì)胞(PBMCs)的分離和培養(yǎng)收集AS患者外周血24例及健康者6例,分為正常組,模型組,XFC組,XFC+AMD3100組及AMD3100組,按步驟分離出PBMC,加入含高糖的培養(yǎng)基培養(yǎng),置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,分別于XFC組,XFC+AMD3100組及AMD3100組中加入最佳劑量XFC含藥血清,XFC+AMD3100,AMD3100。再次培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。免疫熒光法檢測CD62p、CD40L、PDGFA的表達(dá);ELISA法檢測IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR的表達(dá);q RT-PCR檢測SDF-1m RNA、CXCR4m RNA、VEGFAm RNA的表達(dá);WB檢測SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白的表達(dá)。3結(jié)果3.1 AS患者臨床隊列研究結(jié)果3.1.1健脾化濕益腎通絡(luò)方藥使用情況323例患者中成藥服用總次數(shù)為215次,包含有10種,杜仲壯骨丸70次(32.56%);新風(fēng)膠囊50次(23.26%);黃芩清熱除痹膠囊19次(8.83%);雷公藤多苷片15次(6.98%);頸椎活血膠囊10次(4.65%);新癀片10次(4.65%);其他類41次(19.07%)。服用中成藥時間為0.5~50個月,平均(10.12±12.71)個月。323例強直性脊柱炎患者口服中藥湯劑總頻次為556次,包括13種中藥湯劑,四妙散152次(27.34%);獨活寄生湯92次(16.55%);身痛逐瘀湯66次(11.87%);桃紅四物湯53次(9.53%);宣痹湯23次(4.14%);防風(fēng)湯20次(3.60%);二陳湯11次(1.98%);其他類139次(25.00%)。應(yīng)用中藥湯劑時間為0.25~50個月,平均(7.93±11.88)個月。3.1.2各暴露組健脾化濕益腎通絡(luò)藥應(yīng)用頻次323例AS患者應(yīng)用健脾化濕藥共716次,其中非暴露組116次,低暴露組159次,中暴露組90次,高暴露組351次;祛風(fēng)益腎藥共405次,其中非暴露組69次,低暴露組83次,中暴露組48次,高暴露組205次;活血通絡(luò)藥共726次,其中非暴露組125次,低暴露組156次,中暴露組101次,高暴露組344次。3.1.3終點事件與健脾化濕益腎通絡(luò)方藥治療的相關(guān)性隨訪患者中發(fā)生再發(fā)入院4例,其中非暴露組2例,低暴露組1例,中暴露組1例;非暴露組關(guān)節(jié)外病變1例;低暴露組手術(shù)治療1例;無全因死亡。經(jīng)χ2檢驗,暴露強度與終點事件的發(fā)生差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)Logistic回歸模型可見,暴露強度、陳皮、桑寄生、威靈仙因素P0.05,B0且OR值1。3.2 AS患者數(shù)據(jù)挖掘研究結(jié)果3.2.1治療AS的核心處方通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)技術(shù)分析,治療AS的核心處方為:薏苡仁、茯苓、山藥、陳皮、甘草、威靈仙、宧薟草、澤瀉、丹參、雞血藤、桃仁、紅花、蒲公英、白花蛇舌草、杜仲、狗脊。3.2.2治療AS的中藥使用情況調(diào)取治療AS患者使用頻次前20味中藥,主要可分為以下4類:健脾化濕藥(31.61%),活血通絡(luò)藥(26.69%),祛風(fēng)除濕藥(20.09%),益腎清熱藥(21.61%)。3.2.3聚類分析治療AS的中藥配伍情況選取歐式距離為20時,常用中藥配伍為4組:第1組為桃仁,紅花,丹參,陳皮,薏苡仁,威靈仙,山藥,蒲公英;第2組包括茯苓,澤瀉,宧薟草;第3組有杜仲,狗脊;第4組含白花蛇舌草,獨活,伸筋草,雞血藤。3.2.4 AS患者血小板參數(shù)情況PLT與正常參考值相比,升高579例(52.16%),正常505例(45.5%),降低26例(2.34%)。PCT與正常參考值相比,升高643例(57.93%),正常454例(40.9%),降低13例(1.17%)。PDW與正常值相比,升高102例(9.19%),正常788例(70.99%),降低220例(19.82%)。MPV與正常值相比,升高208例(18.74%),正常645例(58.11%),降低257例(23.15%)。3.2.5血小板參數(shù)與AS患者炎癥免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果示:PLT與ESR成正相關(guān);PLT與CRP、C4成正相關(guān);PCT與ESR、Ig G成正相關(guān)。PLT的回歸分析結(jié)果示:CRP的P0.01,OR1;C4的P0.05,OR1;PCT的回歸分析結(jié)果示:ESR的P0.05,OR1;Ig G的P0.01,OR1。3.2.6血小板參數(shù)與炎癥免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析與PLT上升關(guān)聯(lián)度較高(置信度60%,支持度20%,提升度1)五項指標(biāo),分別為CRP上升,C4上升,ESR上升,Ig G上升,C3上升。與PCT上升關(guān)聯(lián)度較高(置信度60%,支持度20%,提升度1)五項指標(biāo),分別為ESR上升,CRP上升,C4上升,Ig G上升,C3上升。3.2.7 AS患者的一般情況依據(jù)是否用健脾單元療法(中藥+XFC+芙蓉膏)治療,將檢索治療有效的1110例AS患者,分為健脾組435例,其中,男性287例,女性148例,平均年齡35.79±10.99歲,平均住院時長17.56±10.42天;單純組490例,男性302例,女性188例;平均年齡34.80±10.19歲,平均住院時長16.75±8.15天。3.2.8健脾組及單純組治療前、后實驗室指標(biāo)的情況治療后,健脾組PLT、ESR、CRP、Ig G、C3、C4指標(biāo)下降明顯,PCT、Ig A指標(biāo)下降;單純組PLT、ESR、CRP、C3指標(biāo)下降明顯,PCT、Ig A、Ig G、C4指標(biāo)下降;兩組間治療后比較,健脾組PLT、PCT、ESR、CRP、C3下降更顯著。3.2.9健脾單元療法藥物與指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析置信度60%,支持度20%且提升度1。新風(fēng)膠囊茯苓陳皮與PLT下降關(guān)系緊密,新風(fēng)膠囊茯苓丹參與CRP下降關(guān)系緊密,新風(fēng)膠囊蒲公英威靈仙與ESR下降關(guān)系緊密,新風(fēng)膠囊茯苓薏苡仁與PCT下降關(guān)系緊密,新風(fēng)膠囊茯苓丹參與C4下降關(guān)系緊密,新風(fēng)膠囊杜仲山藥與MPV上升關(guān)系緊密,山藥蒲公英桃仁與PDW上升關(guān)系緊密,澤瀉威靈仙杜仲與Ig A下降關(guān)系緊密。3.2.10隨機行走評價兩組治療后實驗室指標(biāo)情況采用隨機行走模型評健脾組和單純組AS患者血小板參數(shù)PLT、PCT,免疫炎癥指標(biāo)C4、ESR、CRP的影響。兩組患者PLT每改善一分,需要行走5.89、10.36步;PCT每改善一分,需要行走5.36、6.79步;C4每改善一分,需要行走1.77、1.88步;ESR每改善一分,需要行走2.95、3.01步;CRP每改善一分,需要行走2.37、2.83步;或者每正向行走一步,PLT綜合改善率分別為16.99%、9.66%;PCT綜合改善率分別為18.64%、14.72%;C4綜合改善率分別為56.59%、53.19%;ESR綜合改善率分別為33.85%、33.20%;CRP綜合改善率分別為42.24%、35.28%。3.3體外實驗研究結(jié)果3.3.1 AS患者及健康者的一般情況安徽省中醫(yī)院風(fēng)濕免疫科AS患者外周血標(biāo)本24例。男女各12例;平均年齡為31.66±8.76歲。正常組標(biāo)本來自本院體檢中心正常體檢者6例,男女各3例;平均年齡為29.79±9.69歲。3.3.2 MTT實驗:XFC對PBMCs抑制作用的影響與同期空白對照組相比,中、高劑量XFC組吸光度(A)下降,中劑量XFC組A降低明顯(P0.01,P0.05),各劑量XFC組對PBMC的抑制作用在培養(yǎng)24h后抑制作用逐漸增強,而在48h,抑制作用較24h均有所下降。3.3.3血小板活化指標(biāo)與SDF-1/CXCR4-VEGFA通路及細(xì)胞因子的相關(guān)性血小板活化指標(biāo)CD62p與IL-1β、TNF-α、VEGFA、VEGFR、SDF-1、CXCR4成正相關(guān),與IL-10成負(fù)相關(guān);CD40L與IL-1β、TNF-α、VEGFA、VEGFR、SDF-1成正相關(guān),與IL-10成負(fù)相關(guān);PDGFA與IL-1β、TNF-α、VEGFA、VEGFR、SDF-1、CXCR4成正相關(guān),與IL-10成負(fù)相關(guān)。(P0.01)3.3.4各細(xì)胞中CD62p、CD40L、PDGFA的表達(dá)與正常組相比,模型組CD62p、CD40L、PDGFA表達(dá)增加;與模型組相比,XFC組CD62p、CD40L、PDGFA表達(dá)降低;與XFC組相比,AMD3100組及XFC+AMD3100組CD62p、CD40L、PDGFA降低明顯;與AMD3100組相比,XFC+AMD3100組CD62p、CD40L、PDGFA降低更顯著。(P0.05,P0.01)3.3.5各組細(xì)胞因子的表達(dá)與正常組相比,模型組外周血單核細(xì)胞中IL-1β、TNF-α明顯升高,IL-4、IL-10明顯降低;與模型組相比,XFC組、AMD3100組、XFC+AMD3100組IL-1β、TNF-α降低,IL-4、IL-10升高;與XFC組相比,AMD3100組、XFC+AMD3100組IL-1β、TNF-α降低明顯,IL-10升高明顯;與AMD3100組相比,XFC+AMD3100組IL-1β、TNF-α降低更明顯,IL-4、IL-10升高更明顯。(P0.05,P0.01)3.3.6各組血小板活化指標(biāo)及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)與正常組相比,模型組CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR明顯升高;與模型組相比,XFC組、AMD3100組、XFC+AMD3100組CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR降低;與XFC組相比,AMD3100組、XFC+AMD3100組CD62p、CD40L、PDGFA、VEGFA、VEGFR降低明顯;與AMD3100組相比,XFC+AMD3100組CD62p、CD40L、VEGFA、VEGFR降低更顯著。(P0.05,P0.01)3.3.7各組SDF-1、CXCR4、VEGFA基因表達(dá)情況與正常組相比,模型組SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA表達(dá)水平明顯升高;與模型組相比,XFC組、AMD3100組及XFC+AMD3100組SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA均降低;與XFC組相比,AMD3100組及XFC+AMD3100組SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA降低顯著;與AMD3100組相比,XFC+AMD3100組SDF-1、CXCR4、VEGFA m RNA降低更明顯。(P0.05,P0.01)3.3.8各組SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白的表達(dá)與正常組相比,模型組SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白表達(dá)水平明顯升高;與模型組相比,XFC組、AMD3100組及XFC+AMD3100組SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白的表達(dá)均降低;與XFC組相比,AMD3100組、XFC+AMD3100組SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白表達(dá)均明顯降低;與AMD3100組相比,XFC+AMD3100組SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR蛋白降低更顯著。(P0.05,P0.01)4結(jié)論(1)健脾化濕益腎通絡(luò)方藥可降低患者終點事件發(fā)生的風(fēng)險,長期服用可改善AS預(yù)后。(2)本院治療AS的核心藥物可歸為健脾化濕藥,活血通絡(luò)藥,祛風(fēng)除濕藥,益腎清熱藥4類。(3)AS患者存在血小板活化,且與炎癥免疫反應(yīng)關(guān)系密切。(4)XFC對AS患者血小板活化及炎癥反應(yīng)的改善起重要作用,其機制為阻斷SDF-1/CXCR4-VEGFA通路,抑制血小板活化,下調(diào)IL-1β、TNF-α,上調(diào)IL-4、IL-10,減少炎癥反應(yīng)。(5)XFC有類似于阻斷劑AMD3100的作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R259;TP311.13
【圖文】：

2 結(jié)果2.1 治療 AS 的核心處方共檢索治療有效的 AS 患者 1110 例，通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)技術(shù)分析，治療 AS 的核心處方為：薏苡仁、茯苓、山藥、陳皮、甘草、威靈仙、宧薟草、澤瀉、丹參、雞血藤、桃仁、紅花、蒲公英、白花蛇舌草、杜仲、狗脊。見圖 1。

31圖2 中藥使用情況Fig. 2 Chinese medicine use2.3 聚類分析治療 AS 的中藥配伍情況應(yīng)用聚類分析方法分析安徽省中醫(yī)院風(fēng)濕科治療 AS 的常用中藥，觀察藥物之間的配伍關(guān)系，為進(jìn)一步臨床用藥尋找思路。具體見圖 3。選取歐式距離為 20時，常用中藥配伍為 4 組。具體見表 5。圖 3 聚類分析樹狀圖Fig.3 ClusterAnalysis Tree

圖2 中藥使用情況Fig. 2 Chinese medicine use2.3 聚類分析治療 AS 的中藥配伍情況應(yīng)用聚類分析方法分析安徽省中醫(yī)院風(fēng)濕科治療 AS 的常用中藥，觀察藥物之間的配伍關(guān)系，為進(jìn)一步臨床用藥尋找思路。具體見圖 3。選取歐式距離為 20時，常用中藥配伍為 4 組。具體見表 5。

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3 劉卓R

本文編號：2785970