【摘要】：目的:觀察夾脊電針對脊髓損傷大鼠運(yùn)動功能、脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡及ERK5信號通路相關(guān)因子的影響,闡明ERK5信號通路參與夾脊電針治療脊髓損傷的作用,揭示夾脊電針治療脊髓損傷的抗凋亡機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)一:觀察夾脊電針對SCI大鼠行為學(xué)、組織病理形態(tài)及細(xì)胞凋亡的影響。將54只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)和夾脊電針組(EA)3組,每組根據(jù)術(shù)后1d、3d、7d時間點(diǎn)分為3個亞組,每個亞組6只大鼠,分別給予不同的干預(yù)方式。利用BBB評分觀察各組大鼠雙下肢運(yùn)動功能;利用HE染色觀察脊髓組織病理形態(tài)的改變;應(yīng)用TUNEL檢測脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。實(shí)驗(yàn)二:觀察夾脊電針對ERK5信號通路相關(guān)因子的影響。實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)驗(yàn)一。利用免疫組化及Western Blot觀察脊髓組織中ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2和Bax的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)三:觀察ERK5信號通路在夾脊電針治療脊髓損傷中的作用。將24只鞘內(nèi)置管成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、夾脊電針組(EA)和夾脊電針+抑制劑組(EA+EI)4組,每組6只大鼠,分別給予不同的干預(yù)方式。利用BBB評分觀察各組大鼠雙下肢運(yùn)動功能;利用HE染色觀察脊髓組織病理形態(tài)的改變;應(yīng)用TUNEL檢測脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況;利用免疫組化及Western Blot觀察脊髓組織中ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:(1)BBB評分觀察各組大鼠雙下肢運(yùn)動功能:Sham組大鼠運(yùn)動功能未見明顯異常;Model組大鼠出現(xiàn)雙下肢運(yùn)動功能障礙,與相同時間點(diǎn)Sham組相比較,BBB評分明顯下降,差異顯著(p0.05);EA組與Model組相比,相同時間點(diǎn)BBB評分均高于Model組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(2)HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)變化:HE染色結(jié)果顯示,Sham組各個時間點(diǎn)脊髓組織結(jié)構(gòu)完整,白質(zhì)、灰質(zhì)、脊髓前角、脊髓后角以及中央管等結(jié)構(gòu)均清晰可見,細(xì)胞形態(tài)正常,胞體飽滿,胞核形態(tài)正常,未見出血、神經(jīng)元水腫等現(xiàn)象。1d時Model組可見灶形斑片狀出血,組織間隙增大,正常組織結(jié)構(gòu)被破壞,神經(jīng)元水腫,胞體皺縮,細(xì)胞核固縮,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少;EA組與Model組相比,細(xì)胞形態(tài)差異不明顯,仍可見片狀出血,神經(jīng)元腫脹。3d時Model組仍可見出血,組織間隙變大,有空泡形成,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生較為明顯的改變,細(xì)胞胞體縮小,細(xì)胞核固縮成團(tuán),神經(jīng)細(xì)胞明顯減少,可見大量炎性細(xì)胞浸潤,膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多;EA組與Model組相比,組織損傷程度略輕,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量略增多,炎性浸潤及膠質(zhì)細(xì)胞增多的情況較輕。7d時Model組細(xì)胞間隙進(jìn)一步變大,視野中可見大量空泡,仍可見大量炎性細(xì)胞浸潤,膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多;EA組與Model組相比,細(xì)胞間隙明顯減小,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)優(yōu)于Model組,且神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多,炎性浸潤及膠質(zhì)細(xì)胞增多的情況明顯減輕。(3)TUNEL檢測觀察脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡:Sham組未見明顯神經(jīng)細(xì)胞凋亡,與同一時間點(diǎn)Model組和EA組相比均具有顯著差異(p0.05)。1d時Model組可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,凋亡增多,彌散性分布;EA組與Model組無顯著差異(p0.05)。3d時Model組幾乎不可見正常神經(jīng)細(xì)胞,凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多,多集中分布于損傷區(qū)域周圍;EA組與Model組相比,凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(p0.05)。7d時Model組發(fā)生凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量與3d時相比,數(shù)量減少,散在分布;EA組與Model組相比,神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少,形態(tài)正常的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多(p0.05)。實(shí)驗(yàn)二:(1)免疫組化檢測結(jié)果:與Sham組相比,同時間點(diǎn)Model組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表達(dá)顯著增高(p0.05),并隨著損傷時間延長呈表達(dá)增加趨勢;與Model組相比,同時間點(diǎn)EA組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表達(dá)顯著增高(p0.05),并隨著損傷時間延長呈表達(dá)增加趨勢;與Sham組相比,同時間點(diǎn)Model組Bax表達(dá)水平明顯增高(p0.05),且3d表達(dá)水平最高;與Model組相比,同時間點(diǎn)EA組Bax表達(dá)水平明顯低于Model組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。(2)Western Blot檢測結(jié)果:與Sham組相比,同時間點(diǎn)Model組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增高(p0.05),并隨著損傷時間延長呈表達(dá)增加趨勢;與Model相比,同時間點(diǎn)EA組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表達(dá)顯著增高(p0.05),并隨著損傷時間延長呈表達(dá)增加趨勢;與Sham組相比,同時間點(diǎn)Model組Bax蛋白表達(dá)顯著增高(p0.05),隨受損時間延長Bax表達(dá)水平逐漸升高,在術(shù)后3d達(dá)最值,然后表達(dá)水平逐漸下降;與Model組相比,同時間點(diǎn)EA組Bax表達(dá)水平呈下降趨勢,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。實(shí)驗(yàn)三:(1)BBB評分結(jié)果:與Sham組相比,Model組、EA組、EA+EI組BBB評分均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。EA組大鼠BBB評分顯著高于Model組(p0.05),且EA組大鼠BBB評分顯著高于EA+EI組(p0.05)。(2)HE染色結(jié)果:Sham組脊髓組織結(jié)構(gòu)正常,灰質(zhì)、白質(zhì)、脊髓前角、后角以及中央管結(jié)構(gòu)均清晰可見,細(xì)胞形態(tài)正常,胞體飽滿,胞核形態(tài)正常;Model組視野中可見細(xì)胞間隙顯著增大,大量空泡樣改變,神經(jīng)細(xì)胞明顯減少,可見大量炎性細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞增多;EA組與Model組相比較,細(xì)胞間隙明顯減小,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)優(yōu)于Model組,且神經(jīng)細(xì)胞增多,炎性浸潤及膠質(zhì)細(xì)胞增多的情況明顯減輕;EA+EI組與EA組比較,損傷情況較為嚴(yán)重,可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少。(3)TUNEL檢測結(jié)果:Sham組未見明顯神經(jīng)細(xì)胞凋亡;與Sham組相比較,Model組神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡;與Model組相比較,EA組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯少于Model組(p0.05);與EA組相比較,EA+EI組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于EA組(p0.05)。(4)免疫組化檢測結(jié)果:與Sham組相比,Model組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表達(dá)水平明顯增高(p0.05);與Model組相比,EA組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表達(dá)水平明顯增高(p0.05);與EA組相比,EA+EI組p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(p0.05),ERK5表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);與Sham組相比,Model組Bax表達(dá)水平顯著增加(p0.05);與Model組相比,EA組Bax表達(dá)水平顯著降低(p0.05);與EA組相比,EA+EI組Bax表達(dá)水平亦無明顯變化(p0.05)。(5)Western Blot檢測結(jié)果:與Sham組相比,Model組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯增高(p0.05);與Model組相比,EA組ERK5、p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯增高(p0.05);與EA組相比,EA+EI組p-ERK5、CREB、p-CREB、Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(p0.05),ERK5表達(dá)水平無統(tǒng)計性差異(p0.05);與Sham組相比,Model組Bax表達(dá)水平顯著增加(p0.05);與Model組相比,EA組Bax表達(dá)水平呈下降趨勢,具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);與EA組相比,EA+EI組Bax表達(dá)水平亦無明顯變化(p0.05)結(jié)論:1.夾脊電針能夠改善脊髓損傷大鼠雙下肢運(yùn)動功能;2.夾脊電針能夠減少脊髓損傷組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)脊髓功能恢復(fù);3.脊髓損傷后,ERK5信號通路被激活,其下游因子CREB、Bcl-2的表達(dá)及活化增加;4.夾脊電針調(diào)控ERK5信號通路相關(guān)因子,進(jìn)而抑制脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡,是夾脊電針促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)作用機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R245
【圖文】：

圖 1 ERK5 信號通路示意圖5 的生物學(xué)功能K5 與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等功能有關(guān)[134]。Satako 等 ERK5 探究其作用時發(fā)現(xiàn)，被敲除基因的非洲爪蟾蜍頭元分化受抑制，當(dāng)強(qiáng)制激活 ERK5 后能夠引起神經(jīng)元分化神經(jīng)元分化中占有重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)缺血后 ERK5 能酸毒性，對神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用[136]。Wang 等[137]研究血再灌注后，組織內(nèi) ERK5 被激活，抑制 ERK5 后組織，提示缺血缺氧環(huán)境下，ERK5 被激活起到抑制神經(jīng)元5 信號通路與脊髓損傷損傷是一種復(fù)雜的病理過程，氧化應(yīng)激、神經(jīng)營養(yǎng)因子損傷加重。實(shí)驗(yàn)研究表明，激活 ERK5 能夠抑制神經(jīng)元

術(shù)后 1d、3d、7d 模型組與電針組大鼠 BB，BBB 運(yùn)動功能評分有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05）。此外，d、3d、7d 電針組大鼠 BBB 評分均高于同時間點(diǎn)模型組，著統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05）。（見表 1、圖 2）結(jié)果表明，夾脊電針能夠明顯改善大鼠脊髓損傷后雙下有效地治療脊髓損傷。表 1 各組大鼠雙下肢 BBB 評分組別 1d 3d 7d手術(shù)組 20.2±0.7 20.3±0.8 20.5±模型組 1.5±0.5*2.33±0.5*4.2±電針組 1.8±0.7*3.7±0.7*Δ5.7±0同時間點(diǎn)比較，與假手術(shù)組（S）比較，*p＜0.05；與模型組（

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文髓損傷組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，并且在一定程度上有助于脊髓功能的。（見表 2、圖 3）表 2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量組別 1d 3d 7d假手術(shù)組 1.67±0.82 2.16±1.17 2.83±0.83模型組 6.67±1.63#18.67±2.88#16.67±2.16#電針組 6.00±1.26 12.5±1.87*9.67±3.08*各組同時間點(diǎn)比較，模型組與假手術(shù)組比較，#p＜0.05；電針組與模型組比較，0.05。

【參考文獻(xiàn)】

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5 王U嗙

本文編號：2757924