【摘要】：背景:2017年中國(guó)心血管病報(bào)告指出,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的死亡率占總死亡的40%以上,由于老齡化等多因素的影響,中國(guó)CVD負(fù)擔(dān)日漸加重,患病率及死亡率處于上升階段。研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血缺氧后,心肌細(xì)胞骨架系統(tǒng)可以表現(xiàn)出不同程度的損傷,細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白及其微觀結(jié)構(gòu)的變化也有可能成為評(píng)估心肌缺血損傷的標(biāo)準(zhǔn),AMPK既能調(diào)控細(xì)胞能量代謝,還與細(xì)胞骨架重構(gòu)相關(guān),因此明確AMPK對(duì)心肌細(xì)胞骨架的調(diào)控機(jī)制,對(duì)防治心血管疾病具有重要作用。目的:揭示心肌缺血缺氧后,心肌細(xì)胞骨架的變化情況及其關(guān)鍵調(diào)控途徑,可以為益氣活血方防治心肌缺血提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:研究分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):構(gòu)建急性心肌梗死動(dòng)物模型,按照術(shù)后24小時(shí)心電圖情況隨機(jī)分為四個(gè)組:模型組(M)、益氣活血方組(Y)、美托洛爾組(MT)和開胸不造模的假手術(shù)組(S),共3天、7天和28天三個(gè)時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行超聲、HE染色、透射電鏡檢查,采用Western blot和免疫熒光法觀察各組心肌細(xì)胞骨架蛋白以及p-AMPK的表達(dá)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):采用缺氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞模型,將心肌細(xì)胞分為5組:對(duì)照組(C)和缺氧模型組(M),100μg/ml益氣活血方組(Y1),200μ g/ml益氣活血方組(Y2),400μg/ml益氣活血方組(Y4)。通過實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力,測(cè)定細(xì)胞上清液中LDH、MDA、SOD水平,通過鬼筆環(huán)肽染色法標(biāo)記細(xì)胞骨架染色,Western Blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞骨架微管相關(guān)蛋白表達(dá)以及HIF-1α蛋白的表達(dá)。加入AMPK抑制劑Compound C,并篩選出最佳濃度100μ g/ml(Y1),將心肌細(xì)胞分為5組:對(duì)照組(C)和缺氧模型組(M),益氣活血方組(Y1),益氣活血方+AMPK抑制劑Compound C組(Y1+CC),AMPK抑制劑Compound C組(CC)。Western Blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白以及p-AMPK的表達(dá)。結(jié)果:1.各組心梗大鼠心肌組織病理結(jié)果。S組心肌細(xì)胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰,超微結(jié)構(gòu)Z線及M線清晰可辨,粗細(xì)肌絲排列整齊,肌原纖維垂直于細(xì)胞軸線排列,線粒體可見均勻的基質(zhì)顆粒及排列緊密的線粒體嵴;M組梗死區(qū)室壁變薄,梗死邊緣區(qū)可見充血及炎性細(xì)胞帶,橫切面觀察發(fā)現(xiàn)心肌組織細(xì)胞腫脹,間隙較大,邊緣處于不規(guī)則形狀,超微結(jié)構(gòu)Z線開始排列錯(cuò)亂,線粒體腫脹、基質(zhì)缺失,細(xì)肌絲斷裂,粗肌絲堆積,線粒體腫脹異常且失去完整的形態(tài)結(jié)構(gòu),線粒體嵴模糊不清;Y組和MT組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,部分壞死,梗死邊緣區(qū)可見炎性細(xì)胞帶,橫切面觀察發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞仍腫脹不規(guī)則,但細(xì)胞間間隙減少,炎癥纖維減少,心肌細(xì)胞形狀趨向假手術(shù)組,Y組Z線排列呈波浪狀,粗細(xì)肌絲已融合無明顯分界,但較M組線粒體膜結(jié)構(gòu)尚完整。2.各組大鼠梗死邊緣區(qū)微管、微絲蛋白表達(dá)的情況。Western Blot結(jié)果顯示:與S組相比,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的M組大鼠在心肌組織內(nèi)的微管蛋白、MLCK、Cx43、p-MLC-2表達(dá)水平都有顯著性降低,p-AMPK、MLC-2表達(dá)顯著性升高(P0.01);與M組相比,兩種藥物組心肌組織內(nèi)的α-tubulin、MAP4、MLCK和Cx43、p-MLC-2水平有不同程度的顯著升高,p-AMPK、MLC-2水平有顯著性降低(p0.05);免疫熒光結(jié)果與WB結(jié)果趨勢(shì)相同。3.益氣活血方對(duì)缺氧后H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。與C組相比,缺氧12h和24h后細(xì)胞活性均明顯降低(P0.001)。與M組相比,缺氧12h和24h后不同濃度益氣活血方對(duì)細(xì)胞預(yù)處理可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的損傷,而當(dāng)缺氧12h時(shí),Y1、Y2、Y4組心肌細(xì)胞活性均明顯升高(P0.05)。選擇12h的缺氧時(shí)間作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模型。與C組比較,M組上清液中的LDH和MDA顯著釋放(P0.01),而與M組比較,Y1、Y2、Y4處理后細(xì)胞上清液中LDH和MDA則顯著降低(P0.01)。此外,M組上清液中SOD含量明顯減少(P0.01),Y1處理后可顯著增加H9c2細(xì)胞在缺氧條件下SOD的釋放(P0.01)。采用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞骨架,發(fā)現(xiàn)C組正常心肌細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)被細(xì)胞核包圍,排列成網(wǎng)格,染色均勻。缺氧12h后,M組心肌細(xì)胞骨架受損,結(jié)構(gòu)模糊,晶格結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損,同時(shí)熒光強(qiáng)度較C組降低,部分區(qū)域未染色,形成空泡。各給藥組可改善骨架結(jié)構(gòu)損傷,熒光強(qiáng)度高于單獨(dú)缺氧損傷組,染色異常和核碎裂程度減輕,以Y1給藥組改善較明顯。通過Hoechst33258染色法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn),與C組相比,M組缺氧12h損傷后細(xì)胞核不規(guī)則,分成碎亮片狀,出現(xiàn)凋亡小體等特征,而與M組相比,Y1和Y2可減少核濃縮,減少細(xì)胞碎片。當(dāng)給予了AMPK抑制劑Compound C時(shí),細(xì)胞核致密濃染和碎片明顯增加,凋亡小體增多;分別與Y1和Y2組比較,Y1CC和Y2CC均能有效緩解碎片的增加。4.益氣活血方通過AMPK/MAP4途徑對(duì)缺氧后H9c2心肌細(xì)胞骨架微管蛋白的保護(hù)作用。結(jié)果顯示,與C組比較,M組α-tubulin和β-tubulin的表達(dá)降低(p0.01)。同時(shí),與M組相比,當(dāng)Y1組α-tubulin和P-tubulin的表達(dá)升高(p0.01)�；谇捌谌毖�12h時(shí)細(xì)胞骨架微管蛋白的變化,最后選擇濃度為100μ g/ml的益氣活血方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與C組相比,模型組中p-AMPKα(Thr172)顯著升高,MAP4的表達(dá)顯著降低(P0.01),Y1處理H9c2心肌細(xì)胞后可顯著升高p-AMPKα的表達(dá),上調(diào)MAP4的表達(dá)(p0.01),CC可明顯消除Y1對(duì)微管蛋白的保護(hù)作用。5.益氣活血方通過AMPK/MLCK途徑對(duì)缺氧后H9c2心肌細(xì)胞骨架微絲蛋白的保護(hù)作用。結(jié)果顯示,與C組相比,M組中MLCK水平及p-MLC-2水平明顯降低(p0.01),而MLCK、p-MLC-2的表達(dá)受到CC的抑制,說明益氣活血方對(duì)缺氧后H9c2心肌細(xì)胞骨架損傷中的肌球蛋白的影響與AMPK磷酸化有關(guān)。6.益氣活血方對(duì)缺氧后H9c2心肌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響。與C組相比,M組H9c2細(xì)胞胞漿內(nèi)、胞核內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著性升高(p0.01),經(jīng)過給藥處理后,Y1組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)的HIF-1α蛋白表達(dá)水平能夠一定程度回歸對(duì)照組水平(p0.01)。研究結(jié)論:1.益氣活血方可以通過保護(hù)心梗后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),改善左心功能,減輕心梗后心室重構(gòu)程度。2.益氣活血方可以促進(jìn)缺血缺氧后心肌細(xì)胞骨架微管相關(guān)蛋白α-tubulin、β-tubulin、MAP4,微絲相關(guān)蛋白MLCK、p-MLC-2的表達(dá),表明益氣活血方具有保護(hù)缺血缺氧后心肌細(xì)胞骨架的作用。3.AMPK抑制劑Compound C能夠抑制益氣活血方上調(diào)p-AMPK、微管蛋白MAP4和微絲蛋白MLCK、p-MLC-2的表達(dá),提示益氣活血方可能通過AMPK/MAP4、AMPK/MLCK途徑保護(hù)心肌細(xì)胞骨架中微管和微絲結(jié)構(gòu)和功能,并且在HIF-1α-AMPK途徑在缺氧心肌細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用,從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此我們認(rèn)為AMPK可以作為調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架微管蛋白及微絲肌球蛋白重塑過程相互作用網(wǎng)絡(luò)的橋梁。
【圖文】：

圖１邋ＡＭＰＫ調(diào)控細(xì)胞骨架相關(guān)信號(hào)通路逡逑４天然產(chǎn)物調(diào)控ＡＭＰＫ信號(hào)通路對(duì)心血管的作用逡逑由于西藥長(zhǎng)期服用造成的胃腸道反應(yīng)、肝損害等不良反應(yīng)較多，而中藥特點(diǎn)是毒副逡逑作用小，藥效獨(dú)特，，可以通過多途徑、多靶點(diǎn)、多層面來作用于疾病受體。隨著科技的逡逑

囊逡逑物■■W＿逡逑１Ｍ邋ｔａｎ逡逑圖１－１各組心梗大鼠梗死邊緣區(qū)縱切面心肌組織病理形態(tài)變化（標(biāo)尺＝１００ｕｍ）逡逑Ｓ邐Ｍ邐Ｙ邐ＭＴ逡逑－ｍｍｍｍ逡逑－■

本文編號(hào)：2707788