【摘要】：背景:2017年中國心血管病報告指出,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的死亡率占總死亡的40%以上,由于老齡化等多因素的影響,中國CVD負擔日漸加重,患病率及死亡率處于上升階段。研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血缺氧后,心肌細胞骨架系統(tǒng)可以表現(xiàn)出不同程度的損傷,細胞骨架相關蛋白及其微觀結(jié)構(gòu)的變化也有可能成為評估心肌缺血損傷的標準,AMPK既能調(diào)控細胞能量代謝,還與細胞骨架重構(gòu)相關,因此明確AMPK對心肌細胞骨架的調(diào)控機制,對防治心血管疾病具有重要作用。目的:揭示心肌缺血缺氧后,心肌細胞骨架的變化情況及其關鍵調(diào)控途徑,可以為益氣活血方防治心肌缺血提供理論基礎和實驗依據(jù)。方法:研究分為動物實驗和細胞實驗兩部分。動物實驗:構(gòu)建急性心肌梗死動物模型,按照術(shù)后24小時心電圖情況隨機分為四個組:模型組(M)、益氣活血方組(Y)、美托洛爾組(MT)和開胸不造模的假手術(shù)組(S),共3天、7天和28天三個時間點,進行超聲、HE染色、透射電鏡檢查,采用Western blot和免疫熒光法觀察各組心肌細胞骨架蛋白以及p-AMPK的表達情況。細胞實驗:采用缺氧誘導H9c2心肌細胞模型,將心肌細胞分為5組:對照組(C)和缺氧模型組(M),100μg/ml益氣活血方組(Y1),200μ g/ml益氣活血方組(Y2),400μg/ml益氣活血方組(Y4)。通過實時無標記細胞功能分析儀監(jiān)測細胞活力,測定細胞上清液中LDH、MDA、SOD水平,通過鬼筆環(huán)肽染色法標記細胞骨架染色,Western Blot檢測各組心肌細胞骨架微管相關蛋白表達以及HIF-1α蛋白的表達。加入AMPK抑制劑Compound C,并篩選出最佳濃度100μ g/ml(Y1),將心肌細胞分為5組:對照組(C)和缺氧模型組(M),益氣活血方組(Y1),益氣活血方+AMPK抑制劑Compound C組(Y1+CC),AMPK抑制劑Compound C組(CC)。Western Blot檢測各組心肌細胞骨架相關蛋白以及p-AMPK的表達。結(jié)果:1.各組心梗大鼠心肌組織病理結(jié)果。S組心肌細胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰,超微結(jié)構(gòu)Z線及M線清晰可辨,粗細肌絲排列整齊,肌原纖維垂直于細胞軸線排列,線粒體可見均勻的基質(zhì)顆粒及排列緊密的線粒體嵴;M組梗死區(qū)室壁變薄,梗死邊緣區(qū)可見充血及炎性細胞帶,橫切面觀察發(fā)現(xiàn)心肌組織細胞腫脹,間隙較大,邊緣處于不規(guī)則形狀,超微結(jié)構(gòu)Z線開始排列錯亂,線粒體腫脹、基質(zhì)缺失,細肌絲斷裂,粗肌絲堆積,線粒體腫脹異常且失去完整的形態(tài)結(jié)構(gòu),線粒體嵴模糊不清;Y組和MT組心肌細胞結(jié)構(gòu)紊亂,部分壞死,梗死邊緣區(qū)可見炎性細胞帶,橫切面觀察發(fā)現(xiàn)心肌細胞仍腫脹不規(guī)則,但細胞間間隙減少,炎癥纖維減少,心肌細胞形狀趨向假手術(shù)組,Y組Z線排列呈波浪狀,粗細肌絲已融合無明顯分界,但較M組線粒體膜結(jié)構(gòu)尚完整。2.各組大鼠梗死邊緣區(qū)微管、微絲蛋白表達的情況。Western Blot結(jié)果顯示:與S組相比,3個時間點的M組大鼠在心肌組織內(nèi)的微管蛋白、MLCK、Cx43、p-MLC-2表達水平都有顯著性降低,p-AMPK、MLC-2表達顯著性升高(P0.01);與M組相比,兩種藥物組心肌組織內(nèi)的α-tubulin、MAP4、MLCK和Cx43、p-MLC-2水平有不同程度的顯著升高,p-AMPK、MLC-2水平有顯著性降低(p0.05);免疫熒光結(jié)果與WB結(jié)果趨勢相同。3.益氣活血方對缺氧后H9c2心肌細胞的保護作用。與C組相比,缺氧12h和24h后細胞活性均明顯降低(P0.001)。與M組相比,缺氧12h和24h后不同濃度益氣活血方對細胞預處理可以保護心肌細胞免受缺氧誘導的損傷,而當缺氧12h時,Y1、Y2、Y4組心肌細胞活性均明顯升高(P0.05)。選擇12h的缺氧時間作為后續(xù)實驗的模型。與C組比較,M組上清液中的LDH和MDA顯著釋放(P0.01),而與M組比較,Y1、Y2、Y4處理后細胞上清液中LDH和MDA則顯著降低(P0.01)。此外,M組上清液中SOD含量明顯減少(P0.01),Y1處理后可顯著增加H9c2細胞在缺氧條件下SOD的釋放(P0.01)。采用FITC標記的鬼筆環(huán)肽染色細胞骨架,發(fā)現(xiàn)C組正常心肌細胞的骨架結(jié)構(gòu)被細胞核包圍,排列成網(wǎng)格,染色均勻。缺氧12h后,M組心肌細胞骨架受損,結(jié)構(gòu)模糊,晶格結(jié)構(gòu)嚴重受損,同時熒光強度較C組降低,部分區(qū)域未染色,形成空泡。各給藥組可改善骨架結(jié)構(gòu)損傷,熒光強度高于單獨缺氧損傷組,染色異常和核碎裂程度減輕,以Y1給藥組改善較明顯。通過Hoechst33258染色法檢測各組心肌細胞的凋亡率發(fā)現(xiàn),與C組相比,M組缺氧12h損傷后細胞核不規(guī)則,分成碎亮片狀,出現(xiàn)凋亡小體等特征,而與M組相比,Y1和Y2可減少核濃縮,減少細胞碎片。當給予了AMPK抑制劑Compound C時,細胞核致密濃染和碎片明顯增加,凋亡小體增多;分別與Y1和Y2組比較,Y1CC和Y2CC均能有效緩解碎片的增加。4.益氣活血方通過AMPK/MAP4途徑對缺氧后H9c2心肌細胞骨架微管蛋白的保護作用。結(jié)果顯示,與C組比較,M組α-tubulin和β-tubulin的表達降低(p0.01)。同時,與M組相比,當Y1組α-tubulin和P-tubulin的表達升高(p0.01)�；谇捌谌毖�12h時細胞骨架微管蛋白的變化,最后選擇濃度為100μ g/ml的益氣活血方進行實驗。與C組相比,模型組中p-AMPKα(Thr172)顯著升高,MAP4的表達顯著降低(P0.01),Y1處理H9c2心肌細胞后可顯著升高p-AMPKα的表達,上調(diào)MAP4的表達(p0.01),CC可明顯消除Y1對微管蛋白的保護作用。5.益氣活血方通過AMPK/MLCK途徑對缺氧后H9c2心肌細胞骨架微絲蛋白的保護作用。結(jié)果顯示,與C組相比,M組中MLCK水平及p-MLC-2水平明顯降低(p0.01),而MLCK、p-MLC-2的表達受到CC的抑制,說明益氣活血方對缺氧后H9c2心肌細胞骨架損傷中的肌球蛋白的影響與AMPK磷酸化有關。6.益氣活血方對缺氧后H9c2心肌細胞HIF-1α蛋白表達的影響。與C組相比,M組H9c2細胞胞漿內(nèi)、胞核內(nèi)HIF-1α蛋白表達水平顯著性升高(p0.01),經(jīng)過給藥處理后,Y1組細胞質(zhì)內(nèi)和細胞核內(nèi)的HIF-1α蛋白表達水平能夠一定程度回歸對照組水平(p0.01)。研究結(jié)論:1.益氣活血方可以通過保護心梗后心肌細胞超微結(jié)構(gòu),改善左心功能,減輕心梗后心室重構(gòu)程度。2.益氣活血方可以促進缺血缺氧后心肌細胞骨架微管相關蛋白α-tubulin、β-tubulin、MAP4,微絲相關蛋白MLCK、p-MLC-2的表達,表明益氣活血方具有保護缺血缺氧后心肌細胞骨架的作用。3.AMPK抑制劑Compound C能夠抑制益氣活血方上調(diào)p-AMPK、微管蛋白MAP4和微絲蛋白MLCK、p-MLC-2的表達,提示益氣活血方可能通過AMPK/MAP4、AMPK/MLCK途徑保護心肌細胞骨架中微管和微絲結(jié)構(gòu)和功能,并且在HIF-1α-AMPK途徑在缺氧心肌細胞能量代謝中發(fā)揮重要作用,從而參與調(diào)節(jié)細胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此我們認為AMPK可以作為調(diào)節(jié)細胞骨架微管蛋白及微絲肌球蛋白重塑過程相互作用網(wǎng)絡的橋梁。
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圖１邋ＡＭＰＫ調(diào)控細胞骨架相關信號通路逡逑４天然產(chǎn)物調(diào)控ＡＭＰＫ信號通路對心血管的作用逡逑由于西藥長期服用造成的胃腸道反應、肝損害等不良反應較多，而中藥特點是毒副逡逑作用小，藥效獨特，，可以通過多途徑、多靶點、多層面來作用于疾病受體。隨著科技的逡逑

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本文編號：2707788