【摘要】：目的:沙芪制劑(SQ)是一種探索性研究的新蒙藥制劑,此研究觀察沙芪制劑對自發(fā)性Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的降糖作用及探究其作用的機(jī)制,為該制劑治療Ⅱ型糖尿病提供實驗依據(jù),為進(jìn)一步開發(fā)利用作基礎(chǔ)。方法:1.將KKAy小鼠分為模型對照組(MCG)、沙芪制劑低劑量組(LSQG,0.8g/kg)、沙芪制劑中劑量組(MSQG,1.6g/kg)、沙芪制劑高劑量組(HSQG,3.2g/kg)和鹽酸二甲雙胍組(MEG,2.5g/kg),另設(shè)同源C57BL/6小鼠為正常對照組(NCG)。各小鼠均灌胃給藥8周,每日1次。每周檢測沙芪制劑對體重變化,24h進(jìn)食量,24h飲水量;第0W、2W、4W、8W周測定各組小鼠隨機(jī)血糖和給藥禁食2h血糖,給藥第6周測定糖耐量,24h空腹血糖動態(tài)變化,24h隨機(jī)血糖動態(tài)變化,8周結(jié)束后測定各臟器系數(shù)、血清血糖、胰島素、血脂、肝功指標(biāo)。2.將小鼠的肝臟和胰腺組織病理切片進(jìn)行HE染色,肝臟組織進(jìn)行糖原(PAS)染色、Masson染色、油紅染色,觀察沙芪制劑對KKAy小鼠肝組織病理的影響。3.免疫組化染色觀察沙芪制劑對肝臟PTP1B蛋白表達(dá)的影響;使用Western Blotting法檢測肝臟組織中的PTP1B蛋白表達(dá)情況;PCR法檢測PTP1B核酸表達(dá)情況。4.免疫組化染色觀察沙芪制劑對肝臟P-IRS2、PI3K、P-AKT、GSK3β等蛋白表達(dá)的影響;使用Western Blotting法檢測肝臟組織中的PI3K、AKT、P-AKT、GLUT4、GSK3β等蛋白表達(dá)情況;PCR法檢測IRS2、PI3K、AKT、GLUT4、GSK3β等核酸表達(dá)情況。5.因未測出沙芪制劑LD50,故測其最大耐受量以及對小鼠體重和各臟器系數(shù)的影響。取健康小鼠40只,隨機(jī)分為兩組,每組20只,雌雄各半。第一組為沙芪制劑高劑量組,12小時內(nèi)灌胃給予最大容積(0.2m L/10g)、最大給藥濃度(1g/m L)的沙芪制劑3次(間隔3小時),總劑量為60g/kg,相當(dāng)于臨床人應(yīng)用生藥量的380倍。第二組為空白對照組,灌胃一次給予等容積的蒸餾水。結(jié)果:1.隨著時間的推移,各組小鼠體重逐漸增加,與正常組比較,模型組小鼠體重明顯增加(P0.01);沙芪制劑各組小鼠體重有逐漸降低趨勢,但與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);陽性組對小鼠體重也無明顯影響。與正常組比較,模型組小鼠24h進(jìn)食量和飲水量明顯增加(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組對小鼠進(jìn)食量有減少趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);給藥4周后沙芪制劑各組和陽性組小鼠飲水量開始降低,自第7周高劑量飲水量明顯低于模型組,與陽性組相近(P0.01)。與正常組比較,模型組小鼠的隨機(jī)血糖、給藥禁食2h血糖顯著上升(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組小鼠的隨機(jī)血糖、給藥禁食2h血糖顯著降低(P0.01);糖負(fù)荷30min時,與模型組比較,陽性組抑制血糖升高的幅度最大(P0.01),其次為沙芪制劑高劑量組、沙芪制劑中劑量組、沙芪制劑低劑量組(P0.01);糖負(fù)荷60min時,沙芪制劑各組小鼠血糖水平明顯低于模型組(P0.01),陽性組降低幅度最大,接近于正常組;糖負(fù)荷120min時,陽性組降低幅度最大(P0.01),沙芪制劑各組小鼠血糖水平低于陽性組;AUC順序為正常組陽性組沙芪制劑高劑量組沙芪制劑中劑量組沙芪制劑低劑量組模型組(P0.01)。與正常組比較,模型組小鼠24h空腹血糖顯著上升(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組對小鼠24h空腹血糖禁食2h、6h、12h時有下降趨勢(P0.05),禁食18h、24h空腹血糖比模型組高。與正常組比較,模型組小鼠24h隨機(jī)血糖顯著上升(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑高劑量組對小鼠10:00血糖顯著下降(P0.01),其余時間點無顯著變化。與正常組比較,模型組小鼠肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、腎臟系數(shù)顯著增加(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組組小鼠肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、腎臟系數(shù)無顯著變化。2.血糖指標(biāo):相比于正常對照組,模型對照組的血清GHb、GSP、AGEs水平顯著上升(P0.01);相比于模型對照組,沙芪制劑各組和陽性組的血清GHb、GSP、AGEs水平均顯著減少(P0.01)。胰島素指標(biāo):相比于正常對照組,模型對照組的血清INS和C肽水平顯著上升(P0.01);較模型對照組,沙芪制劑各組和陽性組的血清INS和C肽值均顯著減少、HDL-C水平顯著減少(P0.01)。血脂指標(biāo):相比于正常對照組,模型對照組的血清TC、TG、LDL-C水平顯著上升;相比于模型對照組,沙芪制劑各組和陽性組的血清TC、TG、LDL-C水平明顯減少,HDL-C水平有增加的趨勢。肝功能指標(biāo):相比于正常對照組,模型對照組的血清AST、ALT、直接膽紅素水平顯著上升(P0.01);相比于模型對照組,沙芪制劑各組和陽性組的血清AST、ALT不同程度的降低、直接膽紅素水平顯著降低(P0.01)。相比于正常對照組,模型對照組的血清白蛋白水平顯著下降(P0.01)、總蛋白有降低趨勢;相比于模型對照組,沙芪制劑各組和陽性組的血清總蛋白、白蛋白水平不同程度的上升(P0.05或P0.01)。3.HE染色病理切片:相比于正常對照組,模型對照組的胰腺、肝臟組織病理改變明顯加重。相比于模型對照組,沙芪制劑各組和陽性組的胰腺、肝臟組織病理改變明顯減輕。糖原(PAS)染色病理切片:相比于正常對照組,模型對照組的肝糖原含量明顯減少。相比于模型對照組,各給藥組的肝糖原含量明顯提高。Masson染色:相比于正常對照組,模型對照組的纖維化明顯增多。相比于模型對照組,各給藥組的肝臟組織纖維化明顯減少。油紅染色:相比于正常對照組,模型對照組的肝臟組織脂肪含量明顯增多。相比于模型對照組,各給藥組的肝臟組織脂肪含量明顯減少。4.免疫組化觀察PTP1B蛋白結(jié)果表明:與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織的PTP1B蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組肝臟組織的PTP1B蛋白表達(dá)顯著下降(P0.01)。Western Blotting法檢測小鼠肝臟組織的PTP1B蛋白結(jié)果表明:與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織的PTP1B蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組肝臟組織的PTP1B蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01);PCR法檢測小鼠肝臟組織的PTP1B的m RNA表達(dá)結(jié)果表明:與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織的PTP1B的m RNA表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組肝臟組織的PTP1B的m RNA表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01)。5.免疫組化觀察胰島素信號通路關(guān)鍵因子P-IRS2、PI3K、P-AKT、GSK3β蛋白結(jié)果表明:與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織的P-IRS2、PI3K、P-AKT蛋白表達(dá)顯著下降、GSK3β蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組肝臟組織的P-IRS2、PI3K、P-AKT蛋白表達(dá)顯著升高、GSK3β蛋白表達(dá)顯著下降(P0.01)。Western Blotting法檢測小鼠胰島素通路關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT、P-AKT、GLUT4、GSK3β的結(jié)果表明:與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織的PI3K、P-AKT、GLUT4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)、GSK3β白表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01)、AKT蛋白表達(dá)無顯著差異;與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組肝臟組織的PI3K、P-AKT、GLUT4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)、GSK3β蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01)、AKT蛋白表達(dá)無顯著差異。PCR法檢測小鼠肝臟組織的IRS2、PI3K、AKT、GLUT4、GSK3β的m RNA表達(dá)結(jié)果表明:與正常組比較,模型組小鼠肝臟組織的IRS2、PI3K、AKT、GLUT4的m RNA表達(dá)顯著下調(diào)、GSK3β的m RNA表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01);與模型組比較,沙芪制劑各組和陽性組肝臟組織的IRS2、PI3K、AKT、GLUT4的m RNA表達(dá)顯著上調(diào)、GSK3β的m RNA表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01)。6.沙芪制劑小鼠急性毒性試驗,以最大耐受量(劑量為60g/kg,相當(dāng)臨床擬用量的380倍)口服,觀察14天,結(jié)果高劑量組未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng),所有給藥小鼠未出現(xiàn)死亡,也沒有發(fā)現(xiàn)其它與給藥有關(guān)的表現(xiàn)。結(jié)論:1.沙芪制劑能夠降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的血糖,促進(jìn)糖代謝,改善糖耐量,穩(wěn)定血糖。2.沙芪制劑可調(diào)節(jié)Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠的血脂水平,改善脂代謝。3.沙芪制劑能夠減少Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠胰島β細(xì)胞的損傷,減輕肝臟、胰腺組織的病變,對胰腺、肝臟組織起到一定的保護(hù)作用;沙芪制劑能夠增加Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠肝糖原的含量;沙芪制劑能夠減少Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠肝臟纖維化;沙芪制劑能夠降低Ⅱ型糖尿病KKAy小鼠肝臟脂肪含量。4.沙芪制劑能夠上調(diào)胰島素信號通路關(guān)鍵因子IRS2、PI3K、AKT、GLUT4蛋白和基因的表達(dá),下調(diào)PTP1B、GSK3β蛋白和基因表達(dá),可能是其發(fā)揮降糖作用的內(nèi)在機(jī)制。5.沙芪制劑沒發(fā)現(xiàn)急性毒性。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R29

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2629970