【摘要】：目的 觀察推拿對腦癱(Cerebral palsy,CP)幼鼠海馬炎癥細胞因子TNF-α和IL-10蛋白表達的影響及其DNA甲基化水平,探索推拿對腦癱幼鼠海馬炎癥的拮抗作用及機制。方法 從91只3日齡正常SD幼鼠中篩選符合研究標準的39只雄性幼鼠,隨機分為3組:實驗組(n=13)、模型對照組(n=13)和空白對照組(n=13),實驗組和模型對照組采用左側頸總動脈結扎聯(lián)合缺氧3.5h的方法制備腦癱模型,空白對照組不予處理。造模后第二天(即出生后第5天,Postnatal 5 days,P5),實驗組開始進行推拿干預,1次/日,15 min/次,持續(xù)4周,空白對照組和模型對照組不予任何干預。三組相同的溫度、濕度、生存環(huán)境及喂養(yǎng)方法。三組相同時間點進行動物行為學檢測,即在P26天開始進行水迷宮實驗(Morris Water Maze,MWM)和P31天進行跳臺實驗(Step-down Test,ST)以觀察其學習記憶能力。P33天將全部實驗幼鼠處死,取海馬組織保存于-80℃環(huán)境備用。每組隨機抽取7只用蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測TNF-α和IL-10的蛋白表達水平。將每組中剩余的6只隨機分為兩組,每組3只,分別采用Sequenom質譜檢測法和焦磷酸測序法檢測TNF-α和IL-10 DNA甲基化水平。結果1.水迷宮實驗顯示,與空白對照組相比,實驗組潛伏期時間較長,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與模型對照組相比,實驗組潛伏期時間較短,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與空白對照組相比,模型對照組大鼠找到平臺的潛伏期明顯較長,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。實驗組穿越平臺次數(shù)比模型對照組多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與空白對照組相比,兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與空白對照組相比,模型對照組穿越平臺次數(shù)較少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明實驗組Morris水迷宮成績優(yōu)于模型對照組,空白對照組優(yōu)于實驗組和模型對照組。2.跳臺實驗顯示,實驗組潛伏期時間長于模型對照組,短于空白對照組,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與空白對照組相比,模型對照組的潛伏期時間明顯較短,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。三組跳下平臺次數(shù)比較:空白對照組實驗組模型對照組,實驗組與模型對照組相比次數(shù)較少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),實驗組與空白對照組相比次數(shù)較多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);模型對照組跳下平臺次數(shù)多于空白對照組和實驗組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明實驗組跳臺實驗成績優(yōu)于模型對照組而差于空白對照組。3.western blot檢測顯示,實驗組IL-10蛋白表達水平低于空白對照組,兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。實驗組和空白對照組IL-10蛋白表達水平高于模型對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明實驗組IL-10蛋白表達水平高于模型對照組而低于空白對照組。實驗組TNF-α蛋白表達水平高于空白對照組,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與模型對照組相比,實驗組和空白對照組TNF-α蛋白表達水平較低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明實驗組TNF-α蛋白表達水平低于模型對照組而高于空白對照組。4.Sequenom質譜檢測結果:IL-10基因啟動子區(qū)域,三組間4個Cp G位點相對甲基化率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。模型對照組IL-10基因相對甲基化率略高于空白對照組和實驗組,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明三組間IL-10基因啟動子區(qū)域甲基化水平差異不明顯。TNF-α基因啟動子區(qū)域中,實驗組Cp G_8,9相對甲基化率高于模型對照組而低于空白對照組,三組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);模型對照組Cp G_3、Cp G_8,9和Cp G_14相對甲基化率低于空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明三組間TNF-α基因啟動子區(qū)域甲基化水平有差異。5.焦磷酸測序法檢測結果:實驗組、空白對照組和模型對照組在炎癥因子IL-10的啟動子區(qū)域的4個Cp G位點的DNA甲基化頻率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明三組間IL-10基因啟動子區(qū)域甲基化水平差異不顯著。實驗組、空白對照組和模型對照組在炎癥因子TNF-α的啟動子區(qū)域的8個Cp G位點的DNA甲基化頻率差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與空白對照組相比,實驗組和模型對照組在位點Cp G_1、Cp G_2、Cp G_3、Cp G_4、Cp G_5、Cp G_6、Cp G_7的甲基化頻率均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與模型對照組相比,實驗組在位點Cp G_1、Cp G_2、Cp G_4、Cp G_6、Cp G_7的甲基化頻率明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而在Cp G_8,與空白對照組相比,實驗組和模型對照組甲基化頻率顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明實驗組TNF-α基因啟動子區(qū)域甲基化水平高于模型對照組,而低于空白對照組。結論1.推拿可提高腦癱幼鼠學習記憶能力。2.推拿可降低腦癱幼鼠海馬促炎細胞因子TNF-α蛋白表達水平,提高抗炎細胞因子IL-10的蛋白表達水平,重建腦癱炎癥的相對穩(wěn)態(tài)。3.推拿對腦癱幼鼠海馬炎癥細胞因子TNF-α和IL-10的蛋白表達的調節(jié),其機制可能是推拿調控了炎癥細胞因子TNF-α和IL-10的基因啟動子區(qū)域甲基化水平,同時IL-10蛋白表達的改變可能也與其他因素的調節(jié)有關。
【學位授予單位】：云南中醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R244.1

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