【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)以兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rabbit bone marrow mesenchymal stem cells rabBMSCs)為研究對象。通過鋅鐵調(diào)控蛋白1(ZIP1)體外作用于rabBMSCs,研究ZIP1蛋白體外誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的可能機(jī)制,為臨床治療酒精性股骨頭壞死提供相關(guān)體外研究支持。方法:(1)建立rabBMSCs培養(yǎng)體系,采用不同濃度的酒精(0.00mol/L、0.03 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)處理rabBMSCs6小時,使用Western-Blotting法檢測細(xì)胞中ALP、OCN、I型膠原以及Runx2蛋白表達(dá)情況。(2)構(gòu)建ZIP1蛋白過表達(dá)載體。以全基因合成法合成ZIP1基因的全長序列后采用雙酶切法進(jìn)行酶切,目的片段經(jīng)雙酶切后連接入pcDNA3.1(+)載體中,載體構(gòu)建完成后使用PCR產(chǎn)物電泳及基因測序鑒定,鑒定合格則可用作下一步實(shí)驗(yàn)。(3)篩選ZIP1小干擾RNA(siRNA)。以兔的ZIP1基因?yàn)榘袠?biāo),經(jīng)篩選后由生物公司直接合成3對有效ZIP1 siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3),將3對siRNA分別以25nM濃度轉(zhuǎn)染入rabBMSCs中,同時設(shè)正常組即空白對照組培養(yǎng),36小時后使用R-T PCR對ZIP1mRNA的表達(dá)進(jìn)行定性分析,篩選出抑制率最高效的ZIP1 siRNA序列,構(gòu)建ZIP1 siRNA載體用于后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。(4)ZIP1參與rabBMSCs成骨分化。將實(shí)驗(yàn)分為3個組,A組為正常細(xì)胞培養(yǎng)組,B組為ZIP1過表達(dá)組,C組為ZIP1 siRNA組;細(xì)胞培養(yǎng)至48h后采用Western-Blotting檢測成骨分化相關(guān)蛋白ALP、OCN、I型膠原表達(dá)情況。(5)研究ZIP1蛋白對rabBMSCs凋亡的影響。將實(shí)驗(yàn)分為4組,第1組為正常細(xì)胞培養(yǎng)組,第2組為缺氧缺糖細(xì)胞培養(yǎng)組,第3組為ZIP1過表達(dá)缺氧缺糖培養(yǎng)組,第4組為ZIP1 siRNA缺氧缺糖培養(yǎng)組。細(xì)胞培養(yǎng)2小時后采用tunel法及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,wb檢測凋亡相關(guān)蛋白bax及caspase6表達(dá)。結(jié)果:(1)western-blotting檢測細(xì)胞中alp蛋白相對含量分別為:0.66±0.03、0.58±0.06、0.51±0.02、0.4±0.02、0.38±0.01;i型膠原蛋白相對含量分別為:0.69±0.03、0.54±0.03、0.59±0.05、0.41±0.02、0.23±0.01;ocn蛋白相對含量分別為:1.08±0.03、1.0±0.05、0.93±0.02、0.68±0.03、0.63±0.01;runx2蛋白相對含量分別為:1.08±0.03、0.65±0.01、0.52±0.02、0.41±0.03、0.35±0.02。(2)zip1過表達(dá)載體構(gòu)建后以通用引物進(jìn)行測序鑒定,測序峰圖正常,無雜峰或疊帶,序列對比吻合;(3)懫用real-timepcr技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)zip1mrna的結(jié)果相對含量分別為:1.00±0.32、0.41±0.18、1.96±0.08、0.11±0.07。(4)經(jīng)westernblot檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá),alp蛋白相對含量分別為:1.32±0.04、2.67±0.19、0.8133±0.10;i型膠原蛋白相對含量分別為:1.72±0.09、2.68±0.17、1.54±0.17;ocn蛋白相對含量分別為:1.45±0.15、2.08±0.11、0.87±0.06。(5)tunel法檢測4組細(xì)胞凋亡率分別為(0.66±0.18)%、(13.19±1.8)%、(1.76±0.57)%、(24.43±6)%;(6)流式細(xì)胞儀檢測4組細(xì)胞凋亡率分別為(0.56±0.02)%、(1.29±0.05)%、(0.77±0.04)%、(2.53±0.02)%。(7)western-blotting檢測4組細(xì)胞中bax蛋白相對表達(dá)量分別為0.36±0.02、0.68±0.04、0.68±0.04、1.14±0.3;caspase6蛋白相對表達(dá)量分別為0.30±0.05、0.63±0.02、0.38±0.02、0.95±0.03。結(jié)論:酒精可以抑制rabbmscs中alp、ocn、rnux2、i型膠原蛋白表達(dá),且隨著濃度的增加,抑制效果更顯著。alp、ocn、i型膠原、runx2蛋白可作為rabbmscs向成骨分化鑒定指標(biāo)之一。zip1蛋白可以顯著增加rabbmscs成骨分化指標(biāo)alp、ocn、i型膠原蛋白表達(dá),對rabbmscs向成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。zip1蛋白可顯著抑制rabbmscs凋亡。綜上結(jié)果表明,酒精性股骨頭缺血性壞死時股骨頭骨髓內(nèi)成骨減少,可能與酒精誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化減少有關(guān)。zip1蛋白可誘導(dǎo)rabbmscs成骨分化增多,且可抑制rabbmscs凋亡;zip1蛋白聯(lián)合rabBMSCs可考慮作為治療早期酒精性股骨頭缺血性壞死的新型生物材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R274

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王運(yùn)濤;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(生物醫(yī)學(xué)工程分冊);2003年01期

2 井燕;李良;李毅;陳孟詩;吳文超;陳槐卿;劉小菁;;力學(xué)應(yīng)變對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的影響[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2006年03期

3 崔向榮;蘇偉;黃釗;覃萬安;;電磁場促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志;2011年04期

4 彭飛;鄭亞東;徐西強(qiáng);虞冀哲;吳華;;620nm低能量紅光對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[J];激光生物學(xué)報;2011年03期

5 趙領(lǐng)洲;劉麗;吳織芬;;微米坑/納米管氧化鈦形貌對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用[J];醫(yī)學(xué)爭鳴;2012年04期

6 楊姣;夏雷;湯郁;陸化;費(fèi)小明;;腫瘤壞死因子預(yù)處理促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年03期

7 王晶;張洹;;-80℃一步法凍存對成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響[J];廣東醫(yī)學(xué);2007年03期

8 陳翠平;羅新;;17β-雌二醇對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2007年05期

9 ;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年10期

10 吳玉瓊;房兵;江凌勇;;間歇牽拉應(yīng)變對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響[J];醫(yī)用生物力學(xué);2011年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 鄭亮;鄭雅元;崔燎;劉鈺瑜;;四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

2 吳江;陳槐卿;K-LP.SUNG;;鈦顆粒負(fù)荷影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的機(jī)理[A];全國首屆青年復(fù)合材料學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2007年

3 吳江;陳槐卿;李良;尹光福;K-L P．SUNG;;鈦顆粒負(fù)荷影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的機(jī)理[A];中國復(fù)合材料學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

4 陳海嘯;洪盾;萬曉晨;李繼承;;腸毒素C聯(lián)合維生素C對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響研究[A];2008年浙江省骨科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

5 袁風(fēng)紅;鄒耀紅;高愷言;俞可佳;;地塞米松對體外人骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及成骨分化的影響[A];全國自身免疫性疾病專題研討會暨第十一次全國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

6 宋忠臣;束蓉;董家辰;李松;;低氧對牙周膜成纖維細(xì)胞增殖和成骨分化的影響[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

7 董家辰;束蓉;宋忠臣;;炎癥微環(huán)境對人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與成骨分化的影響[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2014年

8 孫楠;楊力;張振;張樺;陳宏;蔡德鴻;;晚期氧化蛋白產(chǎn)物對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

9 馬雪;孟靜茹;賈敏;王寧;胡靜;周穎;羅曉星;;胰高血糖素樣肽-1類似物對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響[A];第十一屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會論文集[C];2012年

10 林和敏;;成骨分化的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性研究[A];2013年全國激光醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)聯(lián)合會議暨2013年浙江省醫(yī)學(xué)會整形美容學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 龔逸明;microRNAs調(diào)控Satb2介導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 李松濤;EphB信號在軸向仿生壓應(yīng)力調(diào)控MSC成骨分化中的作用和機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 方文;純鈦表面WNT信號通路調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2014年

4 劉世宇;移植外源性MSCs持久恢復(fù)宿主MSCs功能的機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 張莉;Fgfr2~(S252W/+)小鼠骨量、骨結(jié)構(gòu)特性及BMSCs成骨分化調(diào)控機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 劉祥舟;機(jī)械牽伸通過Wnt5a、Wnt5b/JNK信號通路促進(jìn)大鼠肌腱干細(xì)胞成骨分化[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 宋明宇;電磁場對地塞米松干預(yù)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的效應(yīng)及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2015年

8 賈杰;MiR-17-5p調(diào)控非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與增殖的相關(guān)研究[D];華中科技大學(xué);2015年

9 劉旭杰;材料性質(zhì)調(diào)控干細(xì)胞成骨分化及殼聚糖基骨修復(fù)材料[D];清華大學(xué);2015年

10 文采;多孔礦化水凝膠材料誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞成骨分化的研究[D];東南大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 吳小瑩;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對人脂肪干細(xì)胞增殖與成骨分化的作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

2 秦子順;淫羊藿苷對人牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化的影響[D];蘭州大學(xué);2015年

3 劉可;miR-106bE靶向調(diào)控BMP2參與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與體內(nèi)骨形成[D];蘇州大學(xué);2015年

4 付雪杰;MSCs與去分化MSCs在成骨分化過程中免疫原性上調(diào)的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

5 崔陽陽;蛋白激酶C在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

6 嚴(yán)一杰;體外誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 高羽萱;直流微電場對種植體周骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和成骨影響的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

8 郭中豪;甲狀旁腺激素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

9 李慧垠;高脂環(huán)境下大鼠BMSCs成骨分化過程中Wnt通路相關(guān)因子的表達(dá)變化[D];山東大學(xué);2015年

10 聶曉萌;MicroRNA靶向Id1對BMSCs成骨分化的影響[D];山東大學(xué);2015年

，

本文編號：2475750