【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)以兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rabbit bone marrow mesenchymal stem cells rabBMSCs)為研究對(duì)象。通過鋅鐵調(diào)控蛋白1(ZIP1)體外作用于rabBMSCs,研究ZIP1蛋白體外誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的可能機(jī)制,為臨床治療酒精性股骨頭壞死提供相關(guān)體外研究支持。方法:(1)建立rabBMSCs培養(yǎng)體系,采用不同濃度的酒精(0.00mol/L、0.03 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)處理rabBMSCs6小時(shí),使用Western-Blotting法檢測(cè)細(xì)胞中ALP、OCN、I型膠原以及Runx2蛋白表達(dá)情況。(2)構(gòu)建ZIP1蛋白過表達(dá)載體。以全基因合成法合成ZIP1基因的全長序列后采用雙酶切法進(jìn)行酶切,目的片段經(jīng)雙酶切后連接入pcDNA3.1(+)載體中,載體構(gòu)建完成后使用PCR產(chǎn)物電泳及基因測(cè)序鑒定,鑒定合格則可用作下一步實(shí)驗(yàn)。(3)篩選ZIP1小干擾RNA(siRNA)。以兔的ZIP1基因?yàn)榘袠?biāo),經(jīng)篩選后由生物公司直接合成3對(duì)有效ZIP1 siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3),將3對(duì)siRNA分別以25nM濃度轉(zhuǎn)染入rabBMSCs中,同時(shí)設(shè)正常組即空白對(duì)照組培養(yǎng),36小時(shí)后使用R-T PCR對(duì)ZIP1mRNA的表達(dá)進(jìn)行定性分析,篩選出抑制率最高效的ZIP1 siRNA序列,構(gòu)建ZIP1 siRNA載體用于后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。(4)ZIP1參與rabBMSCs成骨分化。將實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組,A組為正常細(xì)胞培養(yǎng)組,B組為ZIP1過表達(dá)組,C組為ZIP1 siRNA組;細(xì)胞培養(yǎng)至48h后采用Western-Blotting檢測(cè)成骨分化相關(guān)蛋白ALP、OCN、I型膠原表達(dá)情況。(5)研究ZIP1蛋白對(duì)rabBMSCs凋亡的影響。將實(shí)驗(yàn)分為4組,第1組為正常細(xì)胞培養(yǎng)組,第2組為缺氧缺糖細(xì)胞培養(yǎng)組,第3組為ZIP1過表達(dá)缺氧缺糖培養(yǎng)組,第4組為ZIP1 siRNA缺氧缺糖培養(yǎng)組。細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后采用tunel法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,wb檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白bax及caspase6表達(dá)。結(jié)果:(1)western-blotting檢測(cè)細(xì)胞中alp蛋白相對(duì)含量分別為:0.66±0.03、0.58±0.06、0.51±0.02、0.4±0.02、0.38±0.01;i型膠原蛋白相對(duì)含量分別為:0.69±0.03、0.54±0.03、0.59±0.05、0.41±0.02、0.23±0.01;ocn蛋白相對(duì)含量分別為:1.08±0.03、1.0±0.05、0.93±0.02、0.68±0.03、0.63±0.01;runx2蛋白相對(duì)含量分別為:1.08±0.03、0.65±0.01、0.52±0.02、0.41±0.03、0.35±0.02。(2)zip1過表達(dá)載體構(gòu)建后以通用引物進(jìn)行測(cè)序鑒定,測(cè)序峰圖正常,無雜峰或疊帶,序列對(duì)比吻合;(3)懫用real-timepcr技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)zip1mrna的結(jié)果相對(duì)含量分別為:1.00±0.32、0.41±0.18、1.96±0.08、0.11±0.07。(4)經(jīng)westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá),alp蛋白相對(duì)含量分別為:1.32±0.04、2.67±0.19、0.8133±0.10;i型膠原蛋白相對(duì)含量分別為:1.72±0.09、2.68±0.17、1.54±0.17;ocn蛋白相對(duì)含量分別為:1.45±0.15、2.08±0.11、0.87±0.06。(5)tunel法檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡率分別為(0.66±0.18)%、(13.19±1.8)%、(1.76±0.57)%、(24.43±6)%;(6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡率分別為(0.56±0.02)%、(1.29±0.05)%、(0.77±0.04)%、(2.53±0.02)%。(7)western-blotting檢測(cè)4組細(xì)胞中bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.36±0.02、0.68±0.04、0.68±0.04、1.14±0.3;caspase6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.30±0.05、0.63±0.02、0.38±0.02、0.95±0.03。結(jié)論:酒精可以抑制rabbmscs中alp、ocn、rnux2、i型膠原蛋白表達(dá),且隨著濃度的增加,抑制效果更顯著。alp、ocn、i型膠原、runx2蛋白可作為rabbmscs向成骨分化鑒定指標(biāo)之一。zip1蛋白可以顯著增加rabbmscs成骨分化指標(biāo)alp、ocn、i型膠原蛋白表達(dá),對(duì)rabbmscs向成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。zip1蛋白可顯著抑制rabbmscs凋亡。綜上結(jié)果表明,酒精性股骨頭缺血性壞死時(shí)股骨頭骨髓內(nèi)成骨減少,可能與酒精誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化減少有關(guān)。zip1蛋白可誘導(dǎo)rabbmscs成骨分化增多,且可抑制rabbmscs凋亡;zip1蛋白聯(lián)合rabBMSCs可考慮作為治療早期酒精性股骨頭缺血性壞死的新型生物材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R274

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本文編號(hào)：2475750