【摘要】：甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥(以下簡稱甲亢)是當(dāng)前最常見的甲狀腺疾病之一�？谇霸摬〉陌l(fā)病機(jī)制尚不明確,尚缺乏針對(duì)性的治療藥物,常規(guī)抗甲狀腺藥物無法解決甲狀腺細(xì)胞過度增殖和甲亢復(fù)發(fā)問題。林蘭教授從醫(yī)50余載,對(duì)甲亢的治療等方面認(rèn)識(shí)深刻,研發(fā)了許多有效的治療方劑,中藥甲亢寧膠囊(以下簡稱“甲亢寧)即是其防治甲亢的臨床經(jīng)驗(yàn)的精髓之一。本論文首先對(duì)導(dǎo)師林蘭教授治療甲亢的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的整理,然后以體外培養(yǎng)的FRTL-5甲狀腺細(xì)胞作為研究對(duì)象,從干擾和過表達(dá)兩個(gè)方面,探討甲亢寧通過調(diào)控ERK信號(hào)通路,抑制甲狀腺細(xì)胞增殖、促其凋亡從而調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞生長的可能分子機(jī)制。1臨床研究目的：基于導(dǎo)師林蘭教授治療甲亢的臨床資料,通過數(shù)據(jù)分析,總結(jié)其治療甲亢的方藥運(yùn)用規(guī)律。結(jié)合與導(dǎo)師交流,人機(jī)結(jié)合,以人為主,總結(jié)其治療甲亢肝損害、甲亢合并白細(xì)胞減少癥、甲亢合并突眼、甲亢伴月經(jīng)病等的臨床經(jīng)驗(yàn)。為總結(jié)和提煉甲亢中醫(yī)藥防治規(guī)律提供循證依據(jù)。方法：將2013年12月-2015年12月林蘭教授在廣安門醫(yī)院內(nèi)分泌門診確診的160例甲亢患者的437診次的病例錄入EXCEL2007表格。利用SPSS19.0軟件、weka3.7數(shù)據(jù)挖掘軟件、Liquorice數(shù)據(jù)挖掘軟件,運(yùn)用頻數(shù)分析、聚類分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等方法分析林蘭教授處方用藥規(guī)律。通過與導(dǎo)師交流,整理導(dǎo)師治療甲亢、甲亢合并肝損害、甲亢合并白細(xì)胞減少癥、甲亢合并突眼、甲亢伴月經(jīng)病等的臨床經(jīng)驗(yàn)。結(jié)果：(1)篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的甲亢病例160例,得到治療本病所涉及的中藥167味,使用總頻次為9032次,其中頻數(shù)在10次以上的藥物共有64味,總頻數(shù)為8634次。其中生龍骨、煅磁石、珍珠母、麥冬、酸棗仁、五味子、夏枯草、法半夏、山慈菇等是林老治療甲亢的核心藥物。(2)將林教授437診次治療甲亢的處方中所有中藥按照藥物出現(xiàn)的總頻次進(jìn)行排序,頻次超過10次的作為高頻中藥。參考第七版《中藥學(xué)》教材及《中華本草》,將69味高頻中藥按照功效進(jìn)行分類,并將各類中藥中的所有藥物使用頻次加和并排序。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,林蘭教授治療甲亢使用最多的是補(bǔ)虛藥、安神藥,其次為清熱藥、活血化瘀藥、平肝息風(fēng)藥等。在補(bǔ)虛類藥物使用上,以用補(bǔ)血藥和補(bǔ)陰藥為主,補(bǔ)氣藥和補(bǔ)陽藥為次。林教授治療甲亢常用具有滋陰潛陽、安神功效的中藥。(3)采用SPSS19.0軟件對(duì)高頻中藥進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示林蘭教授的治療甲亢的處方分為九類：益母草、丹皮、山萸肉、紫河車、當(dāng)歸；鹽杜仲、澤瀉、炒白術(shù)、覆盆子、益智仁、香附、黃連、木香、紅花、川芎、檀香、生黃芪、制遠(yuǎn)志、決明子：菌陳、黃柏、生牡蠣、珍珠母；白芍、生龍骨、五味子、夏枯草、麥門冬、太子參、柏子仁、酸棗仁；山慈菇、牛蒡子；枸杞子、煅磁石、鉤藤；郁金,元胡；半夏,枳實(shí)。(4)采用Liquorice數(shù)據(jù)挖掘軟件對(duì)高頻中藥進(jìn)行分析,結(jié)果顯示林蘭教授的治療甲亢的核心處方以滋陰潛陽、化痰散結(jié)、益氣養(yǎng)陰功效為特點(diǎn),生龍骨、煅磁石、夏枯草、枸杞子、鉤藤、太子參、麥冬、白芍、五味子、生地、熟地、柏子仁、酸棗仁是最常見的方劑組合。(5)采用weka3.7數(shù)據(jù)挖掘軟件,運(yùn)用關(guān)聯(lián)規(guī)則方法分析常用藥對(duì),并結(jié)合與導(dǎo)師交流,總結(jié)出林教授臨床常使用的藥對(duì)為：熄風(fēng)潛陽組合—生龍骨、煅磁石；化痰散結(jié)組合—山慈菇、牛蒡子、浙貝母、連翹；疏肝理氣組合—柴胡、白芍；理氣化痰組合—半夏、枳實(shí)、郁金、元胡；益氣養(yǎng)陰組合—太子參、麥冬、五味子；健脾燥濕組合—蒼術(shù)、厚樸；安神組合—生龍骨、生牡蠣、煅磁石、珍珠母；酸棗仁、柏子仁；健脾化濕組合—茯苓、澤瀉；滋補(bǔ)肝腎組合—覆盆子、益智仁、杜仲；養(yǎng)肝明目組合—枸杞子、決明子；祛風(fēng)明目組合—青葙子、密蒙花。(6)通過與導(dǎo)師交流,總結(jié)了導(dǎo)師治療甲亢分氣滯痰凝、陰虛陽亢、陰虛火旺、氣陰兩虛四型論治,重視化痰活血,強(qiáng)調(diào)配合西藥治療。導(dǎo)師治療甲亢合并突眼,強(qiáng)調(diào)辨主癥論治。治療甲亢合并肝損害,提倡分期論治。治療甲亢伴白細(xì)胞減少癥,以益氣滋陰養(yǎng)血為治療大法。治療甲亢伴月經(jīng)病,應(yīng)用甲狀腺藥物維持治療的同時(shí),運(yùn)用中藥人工周期療法。結(jié)論：本課題首次利用頻數(shù)分析、聚類分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),對(duì)林蘭教授治療甲亢的臨床用藥規(guī)律進(jìn)行了分析,并結(jié)合口傳心授,總結(jié)出了林蘭教授對(duì)甲亢、甲亢突眼、甲亢合并肝損害、甲亢合并白細(xì)胞減少、甲亢伴月經(jīng)病的處方用藥規(guī)律和治療體會(huì)。2實(shí)驗(yàn)研究目的：從ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路探討中藥甲亢寧膠囊治療甲亢的分子機(jī)制。方法：以原代培養(yǎng)的FRTL-5細(xì)胞為研究對(duì)象,采用CCK-8法篩選出甲亢寧抑制FRTL-5細(xì)胞增殖的最佳濃度,作為干預(yù)FRTL-5細(xì)胞的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)共設(shè)立對(duì)照組(Con)、甲亢寧組、甲亢寧+ERK1/2-siRNA組、siRNA陰性序列組(NO)、siRNA干擾組、過表達(dá)慢病毒組、甲亢寧+過表達(dá)慢病毒組、空病毒組(NC)等組別,分別采用CCK-8法檢測甲亢寧對(duì)各組細(xì)胞增殖情況的影響、放免法測定各組細(xì)胞上清中的cAMP釋放量、AV/PI雙染法測定各組細(xì)胞凋亡率、Western Blot法以及RT-qPCR法觀察ERK通路上增殖、凋亡相關(guān)基因(c-Raf、 p-ERK1/2、ERK1/2、Caspase-9、CyclinD1、Bcl-2、Bax)mRNA和蛋白表達(dá)的變化。以ERK1/2為切入點(diǎn),利用RNAi技術(shù)阻斷ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路,并應(yīng)用慢病毒載體對(duì)ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行過度活化,從ERK1/2基因沉默和過表達(dá)兩方面研究甲亢寧調(diào)控FRTL-5細(xì)胞ERK通路的機(jī)制。結(jié)果：(1)本實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)出的FRTL-5細(xì)胞,凍存了足夠的細(xì)胞,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。(2)本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測法觀察出不同甲亢寧濃度、不同干預(yù)時(shí)間的FRTL-5細(xì)胞增殖情況,經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn),最終確定以5.438mg/ml的含甲亢寧的F12完全培養(yǎng)基干預(yù)的第24h作為FRTL-5細(xì)胞的干預(yù)濃度最為適宜。(3)采用CCK-8法證實(shí)了甲亢寧對(duì)FRTL-5細(xì)胞增殖具有抑制作用。(4)采用Annexin V/PI雙染法檢測了甲亢寧對(duì)轉(zhuǎn)染ERK1/2-siRNA和感染ERKl/2過表達(dá)慢病毒的FRTL-5細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,甲亢寧組細(xì)胞發(fā)生凋亡(P0.01),經(jīng)ERK1/2-siRNA干擾后FRTL-5細(xì)胞發(fā)生凋亡,甲亢寧協(xié)同組細(xì)胞凋亡更加顯著(P0.05),ERK1/2-siRNA組、ERK1/ 2-siRNA陰性序列組的凋亡率與對(duì)照組相比增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與甲亢寧組相比,甲亢寧+ERK1/2-siRNA組、甲亢寧+ERK1/2慢病毒組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余各組的細(xì)胞凋亡率與甲亢寧組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)。與ERK1/2-siRNA陰性序列組相比,甲亢寧+ERK1/2-siRNA組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P0.01)。與空病毒組相比,甲亢寧組、甲亢寧+ERK 1/2-siRNA組的凋亡率明顯升高(P0.01)。(5)采用放免法測定各組細(xì)胞上清中的cAMP釋放量,與對(duì)照組相比,ERK1/2-siRNA組、ERK1/2-siRNA陰性序列組的cAMP釋放量無顯著差異,其余各組的cAMP釋放量與對(duì)照組相比,均有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01),其中甲亢寧組的cAMP釋放量降低最為顯著。與甲亢寧組相比,對(duì)照組、ERK1/2-siRNA組、ERK1/2-s iRNA陰性序列組的cAMP釋放量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)。(6)RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,甲亢寧組、ERK1/2-siRNA組、甲亢寧+ERK1/2-siRNA組的c-Raf、ERK1、ERK2、CyclinD1、Bc1-2 mRNA表達(dá)量均顯著降低(P0.01)；甲亢寧組的BaxmRNA、Caspase-9mRNA表達(dá)量增高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ERK1/2-siRNA組、甲亢寧+ERK1/2-siRNA組的BaxmRNA、Ca spase-9mRNA表達(dá)量顯著增高(P0.01)；與對(duì)照組相比,過表達(dá)慢病毒組、甲亢寧+慢病毒組的c-Raf、ERK1、ERK2、Bax的]mRNA表達(dá)量明顯增高(P0.01),CyclinD1mRNA、Bcl-2mRNA的表達(dá)量明顯降低(P0.01)。(7)Western Blot法檢測結(jié)果顯示,甲亢寧組、ERK1/2-siRNA組、甲亢寧協(xié)同組的c-Raf、p-ERK1/2、ERK1/2、CyclinD1、Bcl-2的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P0.01)；甲亢寧組的Caspase-9蛋白表達(dá)量增高(P0.01),ERKl/2-siRNA組、甲亢寧協(xié)同組Bax、Caspase-9的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01)；與對(duì)照組相比,過表達(dá)慢病毒組、甲亢寧+慢病毒組的c-Raf、p-ERK1/2、ERK1/2、Bax的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01),CyclinD1mRNA、Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P0.01)。結(jié)論：ERK1/2-siRNA可以協(xié)同甲亢寧所致的抑制FRTL-5細(xì)胞增殖、促其細(xì)胞凋亡的作用；ERK1/2的過表達(dá)使FRTL-5細(xì)胞獲得更高的增殖與抗凋亡能力,對(duì)甲亢寧的抗藥性顯著增加；甲亢寧對(duì)ERK1/2的磷酸化起阻斷作用,甲亢寧通過調(diào)控ERK1/2的表達(dá)從而調(diào)節(jié)FRTL-5細(xì)胞中c-AMP、c-Raf、Bax、Bcl-2. Caspase-9 及 CyclinD1的表達(dá),而抑制FRTL-5細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡,從而改善甲狀腺細(xì)胞動(dòng)力學(xué)平衡,調(diào)控甲狀腺細(xì)胞生長。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R249;R259

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2433381