【摘要】：目的:通過復(fù)方雷公藤外敷對CIA大鼠血清和滑膜組織中白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素1(Ang-1)的表達以及對滑膜組織ERK通路活化的影響,探討復(fù)方雷公藤外敷治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎濕熱瘀阻證的抗炎、鎮(zhèn)痛與減輕血管翳形成的作用機制。為復(fù)方雷公藤外敷劑在臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供治療方向和科學(xué)依據(jù)。方法:將40只健康雌性SD大鼠逐只稱重后按隨機序列法分為4組,復(fù)方雷公藤外敷(0.50g生藥/(kg·d))、扶他林外敷組(0.016ml/(kg·d))、模型組、正常組。采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型,使用Ⅱ型膠原乳化劑在大鼠尾根部皮下注射,在第七天后于相同部位注射等量Ⅱ型膠原乳化劑以加強免疫,建立CIA大鼠模型。首次免疫后第14天開始涂抹外敷藥物,雷公藤外敷組于大鼠雙后肢膝關(guān)節(jié)以下部位去毛,每次給予外敷制劑0.50g生藥/(kg·d),相當于12.5倍人臨床用量,涂于膝關(guān)節(jié)上下0.5cm范圍及自踝關(guān)節(jié)上0.5cm處以下(包括全部足趾),涂抹時間每天上午9:00-10:00,每天1次,連續(xù)涂抹28天。扶他林外敷組每次給予扶他林乳膠劑0.016ml/(k·d),相當于12.5倍人臨床用量,給藥方法、時間同雷公藤外敷組。模型對照組、正常對照組不給予特殊藥物處理。在外敷過程中觀察記錄各組大鼠的活動情況及行為改變、體重變化、關(guān)節(jié)腫脹度等。外敷結(jié)束后,各組大鼠均于腹主動脈取血,將新鮮血液注入離心管,離心后收集血清,留取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織,留取大鼠后肢踝關(guān)節(jié)及肝、腎、卵巢組織。用ELISA法測定各組大鼠血清及滑膜組織白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素1(Ang-1)的含量水平;Real-time PCR法測定各組大鼠滑膜組織白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素1(Ang-1)的mRNA表達水平;Western Blot法檢測滑膜組織中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路的活化情況;并進行大鼠后肢踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)及肝、腎、卵巢病理檢測。結(jié)果:1.關(guān)節(jié)腫脹度變化首次免疫后第10天左右起,各組造模大鼠后足開始腫脹,第21天左右腫脹程度達到高峰,之后關(guān)節(jié)腫脹程度稍有減輕;模型組大鼠后足關(guān)節(jié)較正常組明顯腫脹(P0.001),兩組外敷組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度均較模型組減輕。復(fù)方雷公藤外敷組大鼠從免疫后2周起后足體積均較模型組同時間降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05 或 P0.01)2.大鼠關(guān)節(jié)病理切片正常組大鼠關(guān)節(jié)面光滑,關(guān)節(jié)間隙大小正常,關(guān)節(jié)囊結(jié)構(gòu)完整,關(guān)節(jié)腔兩面滑膜軟骨結(jié)構(gòu)光滑完整,層次分明,關(guān)節(jié)腔無炎癥細胞浸潤,無滑膜組織增生,關(guān)節(jié)兩端骨組織致密。模型組關(guān)節(jié)間隙明顯增寬,被增生的滑膜組織等完全填充,可見大量炎癥細胞浸潤,關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)面嚴重破壞,骨實質(zhì)侵蝕,結(jié)構(gòu)紊亂。扶他林外敷組和雷公藤外敷組關(guān)節(jié)病理較模型組明顯改善,兩者中以雷公藤外敷組改善程度更為顯著,可見相對清晰的關(guān)節(jié)面、關(guān)節(jié)間隙,關(guān)節(jié)腔有少量滑膜組織和炎癥細胞浸潤,關(guān)節(jié)兩端骨組織結(jié)構(gòu)尚完整,骨實質(zhì)疏松,存在少量炎癥細胞浸潤。3.大鼠肝臟、腎臟、卵巢病理切片雷公藤外敷組大鼠肝臟、腎臟、卵巢病理與正常組大鼠相比未見明顯異常。4.血清細胞因子表達水平與正常組相比,CIA模型組血清中IL-1β、TNF-α、Ang-1含量明顯升高(P0.01);與模型組比較,復(fù)方雷公藤外敷組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、Ang-1含量均降低(P0.01或P0.001)。而各組大鼠血清中VEGF含量均測不到,可能與CIA大鼠中VEGF主要在滑膜血管中分泌有關(guān),具體原因有待進一步探究。5.滑膜組織細胞因子表達水平CIA模型組滑膜組織中IL-1β、TNF-α、VEGF和Ang-1含量較正常組明顯升高(P0.001)。與模型組相比,復(fù)方雷公藤外敷組各細胞因子水平均顯著降低(P0.01 或 P0.001)。6.滑膜組織細胞因子mRNA的表達水平滑膜組織細胞因子mRNA的表達水平趨勢與滑膜細胞因子含量水平一致,CIA模型組滑膜組織IL-1β、TNF-α、VEGF、Ang-1的mRNA表達均較正常組顯著升高,復(fù)方雷公藤外敷組各細胞因子mRNA水平均不同程度降低。(P0.05或P0.01或 P0.001)7.Western Blot檢測滑膜組織ERK通路蛋白的表達與正常組相比,CIA模型組ERK通路蛋白磷酸化水平明顯升高;兩組外敷組與CIA模型組相比,ERK通路蛋白磷酸化水平均有不同程度的降低,雷公藤外敷組降低ERK通路蛋白磷酸化水平更為顯著。結(jié)論:1.復(fù)方雷公藤外敷劑可以減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度,有良好的抑制滑膜組織增殖、減少炎癥細胞的浸潤、延緩骨與軟骨破壞的效果。2.復(fù)方雷公藤外敷劑可以降低CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α、Ang-1的含量,下調(diào)滑膜組織中IL-1β、TNF-α、Ang-1、VEGF的含量及mRNA水平的表達。3.復(fù)方雷公藤外敷劑通過抑制CIA大鼠滑膜組織ERK通路的活化發(fā)揮抑制滑膜組織增殖、減少滑膜中血管新生和血管翳形成的作用。4.復(fù)方雷公藤外敷劑外敷治療無明顯肝、腎、生殖毒性。
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【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R259

【參考文獻】

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本文編號：2414275