【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是由非飲酒因素引起的以肝臟脂肪過(guò)量蓄積以及脂肪變性為特點(diǎn)的病理綜合征。臨床上NAFLD主要表現(xiàn)為肝臟脂肪變性和肝功能損害等。目前,臨床上還沒(méi)有任何一種NAFLD的單一藥物治療方法獲得批準(zhǔn)。隨著全球肥胖人數(shù)的增多,近年來(lái)AFLD患者的數(shù)量也顯著增多。因此研制出有效的治療NAFLD的藥物成為了一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。天麻是一種歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,具有治療頭痛、肢體麻木、驚厥等藥理作用。天麻素(GSTD,分子量：295.3)是天麻的主要有效成分,目前臨床上主要用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我們研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)GSTD通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來(lái)抑制油酸(OA)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性,而天麻粉可顯著緩解飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂肪變性。另外有研究報(bào)道,GSTD在神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞中有顯著的抗炎和抗氧化作用。NAFLD的發(fā)生和發(fā)展與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)有密切的關(guān)系。因此,我們接下來(lái)研究GSTD在治療NAFLD的過(guò)程中的抗炎和抗氧化作用,并探索其可能相關(guān)的信號(hào)通路。在體外實(shí)驗(yàn)中,將HL-7702細(xì)胞進(jìn)行24 h的血清饑餓后,用0.6 mmol/L的OA處理24 h形成脂肪變性模型,同時(shí)加GSTD處理細(xì)胞。以特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以沉默靶基因的表達(dá)；以compound C (10μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h,進(jìn)行信號(hào)通路的阻斷實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞處理完成后,提取蛋白以及總RNA,用于western blot、實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-PCR (RT-PCR)檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。小鼠實(shí)驗(yàn)中一部分雄性C57BL/6小鼠給予正常飼料作為空白對(duì)照組,其余小鼠給予高脂飼料(HFD)(含60 kcal%脂肪,20 kcal%蛋白質(zhì),20 kcal%碳水化合物)。給予HFD的小鼠被分為4組,其中一組作為模型對(duì)照組,其余小鼠在投喂HFD的同時(shí)灌胃給予10 mg/kg、20 mg/kg或50 mg/kg的GSTD。連續(xù)給藥10周,在此期間,一周記錄兩次體重以及攝食量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食12h后眼眶取血,測(cè)定血清膽固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、葡萄糖、胰島素,并取肝臟和脂肪等組織稱重,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。在大鼠模型的實(shí)驗(yàn)中,采用雄性SD大鼠,一部分大鼠給予正常飼料,其余大鼠以高脂高膽固醇(HFHC)飼料(含10%豬油,0.5%膽固醇、0.1%膽酸鹽、89.4%常規(guī)飼料)進(jìn)行喂養(yǎng),8周以后一部分大鼠不予處理,其余灌胃給予GSTD,劑量為20 mg/kg或50 mg/kg共10周。實(shí)驗(yàn)期間一周記錄兩次體重以及攝食量。在實(shí)驗(yàn)的開(kāi)始、第8周末及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食12h后眼眶取血, 測(cè)定血清CHO、TG、葡萄糖、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物,取出肝臟稱重并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。體外結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA能誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),而GSTD能顯著增加HL-7702細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,減少活性氧自由基(ROS)和丙二醛(MDA)的生成,同時(shí)下調(diào)促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL-6)和環(huán)氧化酶2(COX2)的mRNA表達(dá)水平。在HL-7702細(xì)胞中GSTD能促進(jìn)紅系衍生核因子相關(guān)因子2(Nrf2)的絲氨酸40位點(diǎn)(Ser40)的磷酸化并增加其細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,從而刺激抗氧化反應(yīng)元件(ARE)的轉(zhuǎn)錄活性并上調(diào)血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達(dá)。另外GSTD能通過(guò)激活肝激酶B1 (LKB1)來(lái)激活A(yù)MPK。Nrf2 siRNA能完全阻斷GSTD增加Nrf2核轉(zhuǎn)位、刺激ARE轉(zhuǎn)錄以及上調(diào)HO-1表達(dá)的作用。GSTD對(duì)OA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的抑制作用也被Nrf2siRNA所完全阻斷。另外,GSTD激活MPK/Nrf2/HO-1通路的作用及其抗炎抗氧化活性能被AMPK的特異性抑制劑compound C所完全阻斷。在大鼠和小鼠的NAFLD模型中,GSTD能夠顯著抑制肝臟脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn),減少肝臟TG蓄積、肝臟重量和肝指數(shù),降低血清中TG、葡萄糖、胰島素、ALT和AST水平,減少模型動(dòng)物體重的增加和附睪脂肪重量。GSTD還能顯著增加肝臟SOD活性,減少M(fèi)DA濃度,并下調(diào)TNF-α、IL-6和COX2等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。同時(shí),GSTD顯著激活肝臟AMPK/Nrf2/HO-1通路,上調(diào)HO-1的表達(dá)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)GSTD能夠通過(guò)激活肝臟的AMPK/Nrf2信號(hào)通路來(lái)上調(diào)HO-1的表達(dá),從而緩解NALFD中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),并同時(shí)促進(jìn)肝臟脂類代謝。因此,將來(lái)GSTD有望開(kāi)發(fā)成為治療NAFLD的新型臨床藥物。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R259

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本文編號(hào)：2320630