發(fā)布時(shí)間：2018-11-06 19:04

【摘要】：沙棘(胡頹子科Elaeagnaceae沙棘屬Hippophae)是我國(guó)藏族(藏藥名：達(dá)爾布)、蒙古族(蒙藥名：其察日嘎納)、維吾爾族(維藥名：吉汗)等少數(shù)民族的常用藥材,距今已有2000多年的用藥歷史。因其具有利肺止咳、活血化瘀、利心臟血脈、消痰濁等作用特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于藏、蒙、維吾爾等醫(yī)藥中。據(jù)《中國(guó)藥典》《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》(第一冊(cè))《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》以及《維吾爾藥志》等記載,沙棘(H. rhamnoides)(包括多個(gè)亞種)、江孜沙棘(H. gyantsensis)、西藏沙棘(H. tibetana)等多個(gè)物種均作為沙棘藥材的基原在使用。作為典型多基原民族藥,沙棘因其基原多樣性以及同屬植物的形態(tài)相似性,混用、誤用以及替代使用的情況多有發(fā)生,嚴(yán)重影響沙棘藥材的質(zhì)量控制以及臨床使用的“療效等同性”。因此,利用現(xiàn)代儀器設(shè)備和分析方法,對(duì)藥用和非藥用沙棘進(jìn)行快速、客觀、準(zhǔn)確的鑒定,是保證沙棘正確使用,確保其臨床療效,以及推動(dòng)其現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路。目的：為了快速、準(zhǔn)確鑒定多基原民族藥沙棘,采用DNA條形碼和高分辨率熔解曲線技術(shù)(HRM)對(duì)產(chǎn)自中國(guó)的7種7個(gè)亞種的沙棘數(shù)植物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定研究。應(yīng)用~1H-NMR代謝組學(xué)方法探究7種7個(gè)亞種的沙棘藥用部位(果實(shí))代謝成分的差異,并尋找種間代謝標(biāo)志物；運(yùn)用紅外三級(jí)鑒定(Tri-step IR)技術(shù)建立7種7個(gè)亞種沙棘藥用部位的紅外指紋圖譜,尋找其共性與個(gè)性特征。本研究將分子生物學(xué)、代謝組學(xué)及tri-step紅外光譜技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,以期建立復(fù)雜多基原民族藥沙棘的多維鑒定方法,并對(duì)臨床用藥的正確選擇提供理論依據(jù)。方法：(1)提取藥用沙棘和同屬植物DNA,采用通用引物ITS2 (2F/3R)和psbA-trnH(psbAF/trnHF)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對(duì)擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。采用CodonCode Aligner校對(duì)序列質(zhì)量并進(jìn)行拼接,采用MEGA比對(duì)序列,計(jì)算種內(nèi)種間K2P距離,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化NJ樹(shù),同時(shí)根據(jù)遺傳距離分布特征評(píng)價(jià)barcoding gap,最終對(duì)藥用和非藥用沙棘進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定。(2)選擇ITS2通用引物,應(yīng)用DNA條形碼結(jié)合HRM技術(shù)的Bar-HRM對(duì)藥用沙棘及其同屬植物進(jìn)行鑒定。采用植物組織DNA提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)樣本總DNA,通過(guò)Rotor-Gene Q MDx熒光PCR儀上進(jìn)行PCR,獲得藥用沙棘及其同屬植物,以及市場(chǎng)藥材樣本的熔解曲線和T_m值。比較市售沙棘藥材與基原植物的熔解曲線,并通過(guò)PCA分析觀察沙棘基原植物和市場(chǎng)藥材樣本T_m值的分布特征,從而對(duì)其進(jìn)行快速鑒定。將HRM基因分型后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,并將結(jié)果提交到中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì),驗(yàn)證Bar-HRM結(jié)果。(3)應(yīng)用~1H-NMR代謝組學(xué)方法,建立藥用沙棘及其同屬植物果實(shí)的~1H-NMR代謝指紋圖譜,鑒定主要代謝成分。結(jié)合PCA和PLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)藥用和非藥用沙棘進(jìn)行化學(xué)分類研究,并分析種間代謝標(biāo)志物。定量分析信號(hào)分離較好的代謝成分,并采用單因素方差分析判定種間含量差異是否具有統(tǒng)計(jì)意義。(4)應(yīng)用tri-step IR光譜法建立7種7個(gè)亞種沙棘果實(shí),以及藥用沙棘果實(shí)提取物的tri-step IR指紋圖譜,并對(duì)主要吸收峰進(jìn)行歸屬。采用PCA對(duì)不同沙棘以及藥用沙棘果實(shí)提取物進(jìn)行化學(xué)分類分析。同時(shí)比較藥用沙棘果實(shí)提取前后的紅外指紋圖譜中吸收峰的位置、形狀和強(qiáng)度,歸納變化規(guī)律。結(jié)果：(1)沙棘屬植物ITS2序列長(zhǎng)度在221-223 bp之間,比對(duì)后共發(fā)現(xiàn)43個(gè)變異位點(diǎn)、23種單倍型,psbA-trnH序列長(zhǎng)度在300-313 bp之間,比對(duì)后共發(fā)現(xiàn)19個(gè)變異位點(diǎn)、23種單倍型�；贗TS2、psbA-trnH和組合序列ITS2+psbA-trnH的平均種間K2P距離均大于平均種內(nèi)K2P距離。Barcoding gap和系統(tǒng)進(jìn)化NJ樹(shù)結(jié)果表明,組合序列ITS2+psbA-trnH無(wú)論在種級(jí)或是亞種水平都顯示出更高的鑒定效率,單獨(dú)使用ITS2或psbA-trnH序列也能夠鑒定絕大多數(shù)藥用沙棘與非藥用沙棘。(2)比較藥用沙棘及其同屬植物熔解曲線,能夠快速?gòu)姆N級(jí)和亞種水平上鑒定不同沙棘物種。通過(guò)與已知沙棘基原植物的熔解曲線、T_m值的PCA分布特征的比較,也可以對(duì)市場(chǎng)藥材進(jìn)行快速鑒定。鑒定結(jié)果也表明市場(chǎng)沙棘藥材存在一定的摻偽現(xiàn)象。(3)從~1H-NMR代謝指紋圖譜中共鑒定出了甾醇類、五環(huán)三萜類、脂肪酸類、氨基酸類、糖類、黃酮苷元及黃酮苷類等36個(gè)成分。PCA和PLS-DA分析表明,不同沙棘能夠以物種/亞種為單位各自聚在一起,齊墩果酸、丙氨酸、脂肪酸類、蘋(píng)果酸、膽堿、奎寧酸等為種間代謝標(biāo)志物。~1H-NMR定量分析結(jié)果表明,不同沙棘的代謝標(biāo)志物含量各有差異,但這些成分在絕大多數(shù)藥用沙棘中的含量都高于非藥用沙棘。單因素方差分析Turkey多重檢驗(yàn)表明上述代謝成分含量在種間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)建立了7種7個(gè)亞種沙棘果實(shí),以及4種藥用沙棘提取物的FT-IR、 SD-IR和2D-IR指紋圖譜,并對(duì)主要吸收峰進(jìn)行了歸屬：黃酮類、糖類和脂肪酸類化合物中O-H. C-O、C=C、=C-O-C以及C-H等主要官能團(tuán)均在tri-step IR指紋圖譜有相應(yīng)的吸收峰。此外,比較藥用沙棘提取物與原藥材的IR指紋圖譜發(fā)現(xiàn),提取物主要官能團(tuán)的吸收峰強(qiáng)度均有所增加。PCA結(jié)果表明各物種也因化學(xué)成分的差異以物種為單位聚在一起。結(jié)論：(1)DNA條形碼能夠快速、準(zhǔn)確鑒定絕大多數(shù)藥用和非藥用沙棘。在實(shí)際鑒定工作中,可以根據(jù)所需要鑒定物種的實(shí)際情況選擇較為合適的DNA barcode,以達(dá)到鑒定目的。該方法的成功運(yùn)用為尋找沙棘屬植物的最佳鑒別序列和快速鑒定方法提供參考和依據(jù)。(2) Bar-HRM技術(shù)作為一種具有方法通用性和數(shù)據(jù)可視化特點(diǎn)的鑒定方法,不但可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多基原藥材的基原,以及市場(chǎng)藥材真?zhèn)蔚目焖勹b定,同時(shí)也可作為DNA條形碼的補(bǔ)充方法,解決一些亞種鑒定困難等方面的問(wèn)題。該方法為市場(chǎng)藥材的快速檢測(cè)和其他多基原民族藥材的快速鑒定提供新的方法參考。(3)蘋(píng)果酸、膽堿、奎寧酸、L-白雀木醇、α/β-D-葡萄糖等代謝標(biāo)志物可以作為物種鑒別的重要指標(biāo),并實(shí)現(xiàn)不同沙棘的化學(xué)分類鑒定�；趡1H-NMR代謝組學(xué)方法還可以同時(shí)對(duì)沙棘中的代謝成分進(jìn)行定性定量分析,可以作為沙棘藥材或其他民族藥化學(xué)鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)的新方法。(4)在7種7個(gè)亞種沙棘果實(shí)的tri-step IR指紋圖譜中,吸收峰位置和強(qiáng)度的異同點(diǎn)可作為化學(xué)分類的依據(jù)。藥用沙棘果提取物IR指紋圖譜的吸收峰強(qiáng)度較原藥材整體增強(qiáng),表明民族藥沙棘傳統(tǒng)用藥形式水提物和醇提物的科學(xué)性和合理性。該方法快速、無(wú)損、準(zhǔn)確,并為現(xiàn)代監(jiān)控手段分析傳統(tǒng)民族藥的思路提供依據(jù)。創(chuàng)新點(diǎn)：(1)本論文采用基于ITS2和psbA-trnH序列的DNA條形碼分子鑒定方法以及基于DNA條形碼和高分辨熔解曲線(HRM)的Bar-HRM快速檢測(cè)技術(shù),對(duì)7種7個(gè)亞種沙棘進(jìn)行了鑒定研究,建立了相應(yīng)的ITS2和psbA-trnH序列的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù),以及熔解曲線參考基因型。此外,Bar-HRM方法對(duì)DNA條形碼鑒定存在難度的鼠李沙棘和肋果沙棘的亞種進(jìn)行了基因分型和鑒定；同時(shí)也可對(duì)市場(chǎng)藥材進(jìn)行快速檢測(cè),判別其真?zhèn)�。此�?xiàng)研究為藥用、非藥用沙棘和市場(chǎng)藥材的分子生物學(xué)快速鑒定提供了新方法。(2)本論文采用~1H-NMR代謝組學(xué)方法,首次對(duì)產(chǎn)自中國(guó)的7種7個(gè)亞種沙棘果實(shí)進(jìn)行分析,建立代謝物指紋圖譜,檢測(cè)鑒定36種代謝成分。此外,結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析等方法發(fā)現(xiàn)種間代謝標(biāo)志物,并進(jìn)行了NMR定量分析。(3)本論文采用tri-step紅外光譜法建立了7種7個(gè)亞種沙棘果實(shí),以及藥用沙棘果提取物的tri-step IR指紋圖譜,并對(duì)主要吸收峰進(jìn)行了歸屬,并發(fā)現(xiàn)了不同基原沙棘的異同之處。同時(shí)結(jié)合PCA方法對(duì)不同基原沙棘以及藥用沙棘提取物進(jìn)行了化學(xué)分類研究。這為沙棘藥材及提取物等傳統(tǒng)用藥形式的合理性的快速分析監(jiān)控提供新的參考方法。(4)本論文結(jié)合分子生物學(xué)快速鑒定、代謝組學(xué)和tri-step紅外光譜法對(duì)多基原民族藥沙棘進(jìn)行鑒定研究,充分發(fā)揮各方法的優(yōu)勢(shì)之處,從遺傳和化學(xué)雙角度實(shí)現(xiàn)辨真?zhèn)闻c定質(zhì)量的研究目的,并為沙棘的鑒定、化學(xué)分類以及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供了新思路。
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【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R29
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本文編號(hào)：2315186