【摘要】：第一部分 臨床研究目的：通過臨床觀察復(fù)方芪麻膠囊對氣虛痰濁型高血壓患者中醫(yī)癥狀積分、血壓、血流介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能(FMD)、血管緊張素Ⅱ及內(nèi)皮微顆粒(EMPs)水平的影響,探討復(fù)方芪麻膠囊的臨床降壓療效及其對高血壓患者的血管內(nèi)皮保護作用。方法：選取1級、2級氣虛痰濁型原發(fā)性高血壓患者80例,隨機分為對照組及治療組各40例,對照組予以硝苯地平控釋片口服,治療組在對照組基礎(chǔ)上加用復(fù)方芪麻膠囊口服,療程均為2個月。觀察治療前后患者中醫(yī)癥狀積分、血壓、肱動脈血流介導(dǎo)的舒張功能(FMD)、血管緊張素II (AngⅡ)及血漿內(nèi)皮微顆粒水平(EMPs)的變化。結(jié)果：(1)共有74例患者完成研究,其中對照組36例,治療組38例,治療前兩組患者在性別、年齡、病程、血壓級別、中醫(yī)癥狀積分、FMD、AngⅡ及EMPs水平方面比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(PO.05)。(2)兩組在改善中醫(yī)癥狀積分方面比較：治療后,兩組中醫(yī)癥狀積分均較治療前顯著下降(PO.05),治療組中醫(yī)癥狀積分差值及總有效率顯著高于對照組(PO.05)。(3)兩組的降壓療效比較：治療后,兩組SBP及DBP均較治療前顯著下降(P0.05)；治療組患者治療前后SBP差值(即SBP下降幅度)顯著高于對照組(P0.05),DBP下降幅度則無顯著差異(P0.05)。(4)兩組對FMD影響的比較：兩組FMD水平均較治療前顯著上升(P0.05),但治療組FMD水平的升高程度顯著高于對照組(PO.05)。(5)兩組對AngⅡ水平影響的比較：與治療前相比,對照組AngⅡII平無顯著變化(PO.05)；治療組的AngⅡ水平較治療前顯著下降且下降程度也顯著高于對照組(P0.05)。(6)兩組對血漿EMPs水平影響的比較：兩組EMPs水平均較治療前顯著下降(P0.05),但治療組EMPs水平的下降程度顯著高于對照組(P0.05)。結(jié)論：(1)復(fù)方芪麻膠囊不僅能夠降壓,而且可以改善氣虛痰濁型高血壓患者的臨床癥狀；(2)復(fù)方芪麻膠囊具有降低內(nèi)皮損傷因子EMPs及AngⅡ的能力,以發(fā)揮保護內(nèi)皮功能的作用。第二部分實驗研究實驗一：復(fù)方芪麻膠囊對高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷的作用機制研究目的：觀察復(fù)方芪麻膠囊對自發(fā)性高血壓大鼠血壓、血管內(nèi)皮活性物質(zhì)(NO、ET-1及AngⅡ)、氧化應(yīng)激相關(guān)因子(SOD及MDA)和主動脈血管內(nèi)皮形態(tài)學(xué)的影響,探討復(fù)方芪麻膠囊對高血壓血管內(nèi)皮發(fā)揮保護作用的可能機制。方法：隨機將50只14周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)分為SHR組(給予蒸餾水,10ml/Kg/d)、硝苯地平組(硝苯地平,2.7mg/Kg/d)、硝苯地平+芪麻組(硝苯地平,2.7mg/Kg/d+復(fù)方芪麻膠囊,0.9288g/Kg/d)、芪麻高劑量組(復(fù)方芪麻膠囊,3.7125g/Kg/d)和芪麻低劑量組(復(fù)方芪麻膠囊,0.9288g/Kg/d),每組10只,以WKY大鼠10只作為正常對照(給予蒸餾水,10ml/Kg/d),每日灌胃一次,各組大鼠在初次給藥前及給藥后每2周分別采用無創(chuàng)尾動脈測壓法進行測壓,給藥時間為8周。8周后,進行腹主動脈取血,收集并檢測血清中NO、ET-1、AngⅡ、SOD和MDA的水平。取lcm長的主動脈組織行HE染色并于倒置顯微鏡下觀察其組織形態(tài),并分別采用qRT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測主動脈組織中eNOS、NOX4及Sirtl在mRNA和蛋白水平的表達情況。結(jié)果：(1)血壓水平比較：①從第2周開始,硝苯地平組SBP和DBP水平就顯著低于SHR組(P0.05),硝苯地平+芪麻組SBP也顯著低于SHR組(P0.05)；從第4周開始,其余各組SBP及DBP均低于SHR組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01或PO.05)。②從第2周開始,與治療前相比,硝苯地平組及硝苯地平+芪麻組,SBP及DBP出現(xiàn)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；芪麻高劑量組,從第4周開始SBP及DBP出現(xiàn)顯著下降(P0.01)；芪麻低劑量則從第8周開始出現(xiàn)顯著下降(P0.01)。(2)血清NO水平比較：與WKY組相比,其余各組血清NO水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；與SHR組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組血清NO水平顯著上升(P0.01)；與硝苯地平組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量血清NO水平明顯上升(P0.05)；但硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量血清NO水平無顯著差異(P0.05)。(3)血清ET-1水平比較：與WKY組相比,SHR組血清ET-1水平顯著升高(P0.05)；與SHR組相比,硝苯地平+芪麻組及芪麻低劑量組ET-1水平顯著下降(P0.05)；硝苯地平組、硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組組間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(4)血清AngⅡ水平比較：與WKY組相比,SHR組血清AngⅡ水平顯著升高(P0.01)；與SHR組相比,硝苯地平組、硝苯地平+芪麻組及芪麻高劑量組AngⅡ水平顯著下降(P0.05),芪麻低劑量組AngⅡ均數(shù)水平較SHR組有所下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(5)血清MDA水平比較：與WKY組相比,SHR組血清MDA顯著升高(P0.01)；與SHR組相比,各組MDA水平顯著下降(PO.05),與硝苯地平組相比,芪麻高劑量組MDA水平顯著下降(P0.05)。(6)血清SOD水平比較：與WKY組相比,SHR組、硝苯地平組、硝苯地平+芪麻組及芪麻低劑量組血清SOD顯著下降(P0.01)；與SHR組相比,各治療組SOD水平顯著升高(PO.01)；與硝苯地平組相比,芪麻高劑量組SOD水平顯著升高(P0.05)。(7)主動脈形態(tài)學(xué)比較：WKY組大鼠主動脈內(nèi)膜光滑,內(nèi)皮細胞完整,中膜平滑肌細胞排列整齊；SHR組主動脈內(nèi)膜連續(xù)性被破壞,內(nèi)皮細胞可見局部缺損,中膜平滑肌細胞排列不規(guī)則；硝苯地平組可見主動脈內(nèi)膜光整性欠佳,中膜平滑肌細胞排列整齊；與硝苯地平組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組、芪麻低劑量組主動脈壁各層細胞排列規(guī)則,內(nèi)皮細胞未見明顯局部缺損或增厚。(8)主動脈eNOS mRNA水平表達的比較：與WKY組相比,SHR組、硝苯地平組eNOS mRNA表達顯著下降(P0.05)；與SHR組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組eNOS mRNA表達水平顯著升高(PO.05)；硝苯地平組、硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組eNOS mRNA表達水平兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(9)主動脈Sirtl mRNA水平表達的比較：與WKY組相比,SHR組、硝苯地平組Sirtl mRNA表達顯著下降(P0.05)；與SHR組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組Sirtl mRNA表達水平顯著升高(PO.05)；硝苯地平組、硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組Sirtl mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(10)主動脈eNOS蛋白水平表達的比較：與WKY組相比,SHR組及硝苯地平組eNOS蛋白表達水平顯著下降(P0.05)；與SHR組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組eNOS蛋白的表達水平顯著升高(P0.05)；與硝苯地平組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組eNOS蛋白的表達水平顯著升高(PO.05)。(11)主動脈NOX4蛋白水平表達的比較：與WKY組相比,SHR組NOX4蛋白水平表達顯著升高(P0.05)；與SHR組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組NOX4蛋白水平表達顯著降低(P0.05)；與硝苯地平組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組NOX4蛋白水平的表達顯著降低(P0.05)。(12)主動脈Sirtl蛋白水平表達的比較：與WKY組相比,SHR組Sirtl蛋白水平的表達顯著下降P0.01)；與SHR組相比,硝苯地平+芪麻組、芪麻高劑量組及芪麻低劑量組Sirtl蛋白水平的表達水平顯著升高(P0.05)；與硝苯地平組相比,芪麻高劑量組及芪麻低劑量組Sirtl蛋白水平的表達水平顯著升高(PO.05)。結(jié)論：(1)自發(fā)性高血壓大鼠存在內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的障礙；(2)復(fù)方芪麻膠囊能夠增加SHR血清NO并降低ET-1及AngⅡ水平調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能；(3)復(fù)方芪麻膠囊能夠通過增加SHR血清SOD并降低MDA水平提高內(nèi)皮細胞抗氧化應(yīng)激能力；(4)復(fù)方芪麻膠囊具有保護SHR主動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的作用；(5)硝苯地平與復(fù)方芪麻膠囊兩藥聯(lián)用可發(fā)揮更好的降壓及保護血管內(nèi)皮的優(yōu)勢；(6)復(fù)方芪麻膠囊可能通過上調(diào)主動脈內(nèi)皮細胞Sirt1、eNOS的表達促進NO的合成釋放,并通過抑制NOX4的表達降低氧化應(yīng)激反應(yīng),從而起到保護血管內(nèi)皮的作用。實驗二：復(fù)方芪麻膠囊含藥血清對AngⅡ誘導(dǎo)損傷HUVECs的保護作用及機制研究目的：利用AngⅡ刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)建立內(nèi)皮細胞損傷模型,觀察復(fù)方芪麻膠囊含藥血清對細胞凋亡及NO、ROS合成的影響,探討復(fù)方芪麻膠囊對Sirt1、 eNOS及NOX4的調(diào)控途徑,從細胞水平揭示其改善高血壓內(nèi)皮細胞損傷潛在的分子機制。方法：(1)用MTT法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)被不同濃度AngⅡ(10-8mol/L、 10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L)干預(yù)一定時間(12h、24h、48h)后的細胞活性情況,最終確定建立HUVECs損傷模型的AngⅡ濃度為10-6mol/L,作用時間為24h。(2)用MTT法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)被不同濃度復(fù)方芪麻膠囊含藥血清(5%、10%、20%)干預(yù)一定時間(12h、24h、48h)后的細胞活性變化,最終表明5%、10%、20%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清均無細胞毒性。(3) HUVECs分組培養(yǎng)(①空白組；②模型組；③5%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組；④10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組；⑤20%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組；⑥阿托伐他汀鈣組),24h后收集細胞或上清進行相關(guān)實驗檢測。(4)用MTT法檢測各組HUVECs的活性。(5)在倒置顯微鏡觀察各組HUVECs的形態(tài)學(xué)變化。(6)用硝酸還原酶法檢測各組HUVECs培養(yǎng)基中一氧化氮(NO)的濃度。(7)用流式細胞技術(shù)檢測各組HUVECs的活性氧水平及細胞凋亡率情況。(8) qRT-PCR技術(shù)檢測各組HUVECs中eNOS、NOX4及Sirtl在mRNA水平的表達情況。(9) Western Blot技術(shù)檢測各組HUVECs中eNOS、NOX4及Sirtl在蛋白水平的表達情況。結(jié)果：(1)細胞活性比較：與空白組相比,模型組細胞活性顯著降低(PO.01)；與模型組相比,各濃度復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組的細胞活性顯著升高(P0.01)。(2)細胞形態(tài)學(xué)觀察：空白組內(nèi)皮細胞呈扁平狀圓形或梭狀鋪路石狀排列,核仁明顯,輪廓清晰；模型組多數(shù)細胞皺縮呈圓形或橢圓形,細胞間間隙變大,核仁顯示不清；復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組中部分細胞皺縮呈圓形或橢圓形,細胞間聯(lián)系較緊密,核仁較清晰,其中10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清細胞形態(tài)較低濃度含藥血清的細胞形態(tài)改善；經(jīng)阿托伐他汀鈣處理的細胞形態(tài)與正常組相似。(3)NO水平的比較：與空白組相比,其余各組的細胞培養(yǎng)基中NO水平顯著降低(P0.01)；與模型組相比,各濃度復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組培養(yǎng)基中NO水平顯著升高(P0.05)；各藥物干預(yù)組中,NO含量以10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組最高,其次為20%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組,最低為5%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組(PO.05)。(4) HUVECs內(nèi)ROS水平的比較：與空白組相比,其余各組的細胞內(nèi)ROS含量顯著升高(P0.01)；與模型組相比,各藥物干預(yù)組的ROS含量顯著降低(P0.05)；各藥物干預(yù)組間的ROS含量均存在顯著差異,其中10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組細胞內(nèi)ROS含量最低,其次是阿托伐他汀鈣組,再次是20%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組,ROS含量最高為5%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組(PO.05)。(5)HUVECs凋亡水平的比較：與空白組相比,其余各組凋亡率顯著升高(P0.01)；與模型組相比,各藥物干預(yù)組的細胞凋亡率顯著降低(PO.01)；各藥物干預(yù)組間的細胞凋亡率也存在顯著差異,其中10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組與阿托伐他汀鈣組的細胞凋亡率最低(P0.05),其次是20%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組,細胞凋亡率最高為5%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組(P0.01)。(6) eNOS mRNA水平表達的比較：與空白組相比,各組細胞eNOS mRNA表達顯著下降(P0.05)；與模型組相比,10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組eNOS mRNA表達水平顯著升高(P0.01)；與10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組相比,apocynin組及sirtinol組eNOS mRNA表達顯著下降(P0.05); apocynin組及sirtinol組兩者eNOS mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(7) NOX4 mRNA水平表達的比較：與空白組相比,各組細胞NOX4 mRNA表達顯著升高(P0.01)；與模型組相比,10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組、阿托伐他汀鈣組及apocynin組NOX4 mRNA表達水平顯著降低(P0.01), sirtinol組NOX4 mRNA表達水平顯著升高(P0.01)；與sirtinol組相比,10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組、阿托伐他汀鈣組及apocynin組NOX4 mRNA表達水平顯著降低(O0.01)。(8)Sirtl mRNA水平表達的比較：與空白組相比,模型組、apocynin組及sirtinol組Sirtl mRNA表達顯著下降(P0.05)；與模型組相比,10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組Sirtl mRNA表達水平顯著升高(P0.01), sirtinol組Sirtl mRNA表達水平顯著降低(P0.05)；與10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組相比,apocynin組及sirtinol組Sirtl mRNA表達顯著降低(P0.05)；與apocynin組相比,sirtinol組Sirtl mRNA表達水平顯著降低(P0.05)。(9) eNOS蛋白水平表達的比較：與空白組相比,各組細胞eNOS蛋白水平表達顯著下降(P0.01)；與模型組相比,10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組eNOS蛋白水平表達顯著升高(P0.01),sirtinol組eNOS蛋白水平表達顯著降低(P0.01)；與10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組相比,apocynin組及sirtinol組Sirtl蛋白水平表達顯著降低(P0.05)；與sirtinol組相比,apocynin組eNOS蛋白水平表達顯著升高(P0.01)。(10)NOX4蛋白水平表達的比較：與空白組相比,模型組、10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組、阿托伐他汀鈣組及sirtinol組細胞NOX4蛋白水平表達顯著升高(P0.01)；與模型組相比,10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組、阿托伐他汀鈣組及apocynin組NOX4蛋白表達顯著降低(P0.01),sirtinol組NOX4蛋白水平表達顯著升高(P0.01)；與10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組相比,sirtinol組NOX4蛋白水平表達顯著升高(P0.01)；與sirtinol組相比,apocynin組NOX4蛋白水平表達顯著降低(P0.01)。(11) Sirtl蛋白水平表達的比較：與空白組相比,各組細胞Sirtl蛋白水平表達顯著下降(P0.05)；與模型組相比,10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組Sirtl蛋白水平表達顯著升高(P0.01),sirtinol組Sirtl蛋白水平表達顯著降低(P0.05)；與10%復(fù)方芪麻膠囊含藥血清組及阿托伐他汀鈣組相比,apocynin組及sirtinol組Sirtl蛋白水平表達顯著降低(P0.05)；與sirtinol組相比,apocynin組Sirtl蛋白表達顯著升高(P0.05)。結(jié)論：(1) 10-6mol/L濃度的AngⅡ干預(yù)24h可用于制作HUVECs的損傷模型。(2)復(fù)方芪麻膠囊含藥血清可以改善受損的HUVECs的細胞形態(tài),其中以10%濃度效果最佳。(3)復(fù)方芪麻膠囊含藥血清能夠明顯提高HUVECs培養(yǎng)基中NO的水平,并抑制ROS的產(chǎn)生以減輕氧化應(yīng)激對細胞造成的損傷,其中以10%濃度效果最佳。(4)復(fù)方芪麻膠囊含藥血清能夠明顯抑制HUVECs的凋亡,其中以10%濃度干預(yù)后的細胞凋亡率最低。(5) AngⅡ能夠抑制HUVECs中eNOS及Sirtl的表達并促進NOX4的表達,從而對內(nèi)皮細胞造成損傷；(6)復(fù)方芪麻膠囊及阿托伐他汀鈣能夠通過上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞eNOS及Sirtl的表達水平并抑制NOX4表達對內(nèi)皮細胞起保護作用;(7)復(fù)方芪麻膠囊可能通過促進上游基因Sirtl的表達,在上調(diào)eNOS促進NO生成的同時下調(diào)NOX4減少ROS的產(chǎn)生,保護內(nèi)皮細胞功能。
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【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R259

【參考文獻】

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1 劉秋江;靳利利;蘇慧;王清海;;復(fù)方芪麻膠囊對氣虛痰濁型高血壓患者左心室質(zhì)量指數(shù)的影響[J];廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2011年05期

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本文編號：2259950