本文選題：電針耐受 + 大鼠�。� 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：電針具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng),已廣泛應(yīng)用于多種疾病,特別是疼痛性疾病的治療。在臨床上,人們發(fā)現(xiàn)反復(fù)或持續(xù)電針會引起電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)下降,即電針耐受。電針耐受是針刺治療的一種負效應(yīng),引起了臨床工作者和研究人員的極大關(guān)注。大量的研究表明電針在誘導(dǎo)阿片物質(zhì)(腦啡肽、內(nèi)啡肽等)釋放,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的同時,可引起抗阿片物質(zhì)(如膽囊收縮素、孤啡肽、血管緊張素II等)的釋放增加。盡管這些研究闡明了這些活性物質(zhì)的作用及其相互間的關(guān)系,電針耐受的機制仍不清楚。研究表明電針與嗎啡有交叉耐受現(xiàn)象。人們在研究嗎啡耐受時發(fā)現(xiàn)micro RNA(mi RNA)與興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體(Excitatory amino acid transporters,EAAT)均參與嗎啡耐受。然而,mi RNA和EAAT是否參與電針耐受尚無報道。因此,本研究旨在探索mi RNA與EAAT在電針耐受中的作用。1.電針耐受大鼠模型的建立篩選單次電針后痛閾升高50%的SD大鼠(有效鼠)用于正式實驗。將60只有效鼠(250±20 g)隨機分為3組,每組20只:電針組,對照組和假針組。電針組大鼠每天電針1次,連續(xù)電針8 d;對照組大鼠僅做保定處理;假針組大鼠只扎針、不通電。采用鼠尾光照測痛法測定大鼠痛閾。記錄電針前后的大鼠痛閾,計算每次電針的痛閾變化率。結(jié)果顯示,對照組與假針組的大鼠痛閾變化率無顯著差異(p0.05)。電針組大鼠的痛閾變化率隨著電針次數(shù)的增加而下降(p0.05);電針組大鼠的痛閾變化率在第1至6天高于(p0.05)對照組,在第7、8天與對照組無差異(p0.05)。提示電針耐受的形成。2.電針耐受大鼠下丘腦mi RNA的差異表達為探索下丘腦mi RNA在電針耐受中的作用,本研究采取電針耐受大鼠下丘腦進行高通量深度測序,運用q PCR方法對測序結(jié)果進行驗證,并進一步通過側(cè)腦室微注射技術(shù)對深入研究差異mi RNA在電針耐受中的作用。在mi RNA深度測序?qū)嶒炛?選取兩窩雄性有效鼠(250±20 g),每窩6只,共計12只。將大鼠分為兩組,即電針組和對照組。按照配對實驗方法進行同窩配對,每對大鼠中一只接受電針,另一只接受對照處理。電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8 d電針。第8天電針后迅速處死,取下丘腦。其中同組同窩的3只大鼠樣品混合為一個樣品池(即每組樣品兩個樣品池),進行測序建庫。利用高通量深度測序技術(shù)和生物信息學方法分析電針組與對照組間的mi RNA差異表達,并對差異表達mi RNA進行靶基因預(yù)測和功能富集分析。在q PCR驗證實驗中,選取9只雄性有效鼠(250±20 g),隨機分為3組,即對照組、電針組和假針組,每組3只。電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8 d電針。第8天電針后迅速處死,取下丘腦、丘腦、海馬,分別采用q PCR法對差異mi RNA進行驗證。選取測序結(jié)果中表達量最高的12個差異mi RNA進行驗證。在側(cè)腦室注射驗證實驗中,選取132只雄性有效鼠(250±20 g),隨機分為兩組,即電針組與對照組,每組66只。各組大鼠分別接受側(cè)腦室注射4種agomir(ago-7a-5p、ago-204-5p、ago-148a-3p、ago-370-3p),4種antagomir(antago-let-7b-5p、antago-107-3p、antago-124-3p、antago-221-3p),negative agomir,negative antagemir或生理鹽水(每6只大鼠注射同一種藥物)。注射后,電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8 d電針,并于每次電針前后測定痛閾,計算痛閾變化率。Mi RNA深度測序結(jié)果顯示:測序分析共得到49個差異表達mi RNA。電針組中34個mi RNA表達下調(diào),15個mi RNA表達上調(diào)。這些差異mi RNA可能通過MAPK通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子、脂肪酸代謝等通路,以及神經(jīng)沖動傳導(dǎo)、受體信號通路和基因表達調(diào)節(jié)等生物學機制參與電針耐受。進一步QPCR驗證結(jié)果顯示,電針組大鼠下丘腦中,mi R-124-3p、mi R-221-3p、mi R-let-7b-5p和mi R-107-3p上調(diào)(p0.05),mi R-7a-5p、mi R-148a-3p、mi R-204-5p、mi R-370-3p、mi R-434-5p和mi R-344b-3p下調(diào)(p0.05),與高通量測序結(jié)果基本一致,印證了測序結(jié)果的可靠性。電針組大鼠丘腦中,5個mi RNA上調(diào)(p0.05),4個mi RNA下調(diào)(p0.05)。電針組大鼠海馬中,5個mi RNA上調(diào)(p0.05),2個mi RNA下調(diào)(p0.05)。這些mi RNA在不同部位表達水平有所差異,提示在電針耐受過程中,mi RNA的表達存在區(qū)域特征。側(cè)腦室注射實驗的結(jié)果顯示:電針組中,注射agomir-148a-3p的大鼠在4~8 d、注射agomir-370-3p的大鼠在6~8 d、注射antagomir-let-7b和antagomir-107-3p的大鼠在3~8 d,以及注射antagomir-124-3p的大鼠在2 d和6~8 d的痛閾變化率高于(p0.05)電針+生理鹽水組,提示mi R-148a-3p、mi R-370-3p、let-7b-5p、mi R-107-3p以及mi R-124-5p參與電針耐受。3.電針耐受大鼠脊髓谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達時程變化為探索脊髓EAAT在電針耐受中的作用,本研究采用q PCR和western blot方法檢測電針耐受過程中脊髓EAAT的動態(tài)表達,并通過鞘內(nèi)注射EAAT激動劑(利魯唑),觀察EAAT活性增強后對電針耐受的影響。為確定電針后的最佳采樣時間,本研究先測定了單次電針后的脊髓EAAT表達時程。選取36只有效鼠(250±20 g)進行單次電針,分別于電針前(0 h)和電針后0.5、1、2、4、8 h采取脊髓L4-5段,檢測三種脊髓EAAT的動態(tài)表達,包括L-谷氨酸-L門冬氨酸轉(zhuǎn)運體(L-glutamate-L-aspartate transporter,GLAST),谷氨酸轉(zhuǎn)運體1(glutamate transporter1,GLT-1)和興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體1(excitatory amino-acid carrier 1,EAAC1)。并將其表達峰值時間點作為后續(xù)采樣時間點的依據(jù)。為探索反復(fù)電針對脊髓谷氨酸轉(zhuǎn)運體表達時程的影響,選取120只有效鼠(250±20 g),隨機分兩組,即電針組與假針組,每組60只。電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8 d電針,并于電針前后測定痛閾,計算痛閾變化率。各組大鼠隨機選取12只,分別于電針前(0 d)和電針后2、4、6、8 d采取脊髓L4-5段,檢測EAAT表達;其中6只大鼠在電針后2 h采樣,用于檢測GLAST與GLT-1的表達;另6只在電針后4 h采樣,用于檢測EAAC1的表達。為探索鞘內(nèi)注射利魯唑(EAAT激動劑)對電針耐受的影響,選取36只有效鼠,隨機分為6組:電針+溶劑組、電針+5μg利魯唑組、電針+10μg利魯唑組、電針+20μg利魯唑組、溶劑組、20μg利魯唑組,每組6只大鼠。其中電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8 d電針;利魯唑處理組的大鼠在每次電針前注射利魯唑。每日電針前后測定大鼠痛閾,并計算痛閾變化率。單次電針的實驗結(jié)果顯示,與0 h相比,GLAST與GLT-1的基因表達在各時間點無顯著變化(p0.05),而蛋白表達在2、4和8 h升高(p0.05),并于4 h達到峰值。EAAC1的基因表達在電針后1、2、4、和8 h升高(p0.05),蛋白表達在2、4和8 h升高(p0.05),并于2 h達到表達峰值。因此,在反復(fù)電針實驗中,檢測GLAST與GLT-1的樣品在電針后4 h采取,而檢測EAAC1的樣品在電針后2 h采取。反復(fù)電針的實驗結(jié)果顯示,GLAST與GLT-1的基因表達與假針組相比無顯著差異(p0.05),而EAAC1的基因表達在第2、4天高于(p0.05)假針組,第8天低于(p0.05)假針組。三種脊髓EAAT的蛋白表達均隨電針次數(shù)的增加而下降,并與痛閾變化率呈正相關(guān)(p0.05)。至第8天時,三種脊髓EAAT的蛋白表達與假針組無差異(p0.05)。進一步的鞘內(nèi)注射實驗結(jié)果顯示,電針+20μg利魯唑組的痛閾變化率在第4~8天高于(p0.05)電針+溶劑組,電針+10μg利魯唑組的大鼠痛閾變化率在第5~8天高于(p0.05)電針+溶劑組,而電針+5μg利魯唑組的大鼠痛閾變化率與電針+溶劑組無顯著差異(p0.05)。提示鞘內(nèi)注射利魯唑可劑量依賴性地部分逆轉(zhuǎn)電針耐受的形成。這些結(jié)果提示脊髓EAAT參與電針耐受。
[Abstract]:The results showed that the rate of pain threshold in electroacupuncture group was higher than that in control group ( P < 0.05 ) . A total of 12 male effective rats ( 250 鹵 20 g ) were randomly divided into two groups : control group , electroacupuncture group and sham acupuncture group . The results showed that in the electroacupuncture group , 5 mi RNA was up - regulated ( p . 05 ) , mi R - 7a - 5p , mi R - 370 - 3P , mi R - 204 - 5p , mi R - 370 - p , mi R - 434 - 5p , mi R - 370 - 3P , mi R - 434 - 5p , mi R - 370 - 3P , mi R - 434 - 5p , mi R - 370 - 3P , mi R - 434 - 5p and mi R - 344b - p were down - regulated ( p . 05 ) . In this study , the dynamic expression of EAAT was detected by means of q - PCR and western blot . In order to determine the optimal sampling time after electroacupuncture , the expression of EAAT in spinal cord after single electroacupuncture was measured . In order to explore the effect of repeated electric acupuncture on the expression of glutamate transporter in spinal cord , 120 effective rats ( 250 鹵 20 g ) were randomly divided into 6 groups : electroacupuncture + solvent group , electroacupuncture + 5 渭g riluzole group , electroacupuncture + 10 渭g riluzole group , electroacupuncture + 20 渭g riluzole group , solvent group and 20 渭g riluzole group . The expression of EAAC1 was higher than that of the sham acupuncture group on the 2nd and 4th days . The expression of EAAC1 decreased with the increase of the number of electroacupuncture plus the rate of change of pain threshold ( p < 0.05 ) . The results showed that the rate of change of pain threshold in the EA group was higher than that in the sham acupuncture group ( P < 0.05 ) . The results showed that the rate of pain threshold change in the electroacupuncture + 20 渭g lirouzole group was higher than that in the electroacupuncture + solvent group ( P < 0.05 ) .
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R245

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本文編號：1955927