【摘要】 目的：采用多種方法對(duì)亳菊總黃酮進(jìn)行藥效學(xué)的初步研究；通過藥代動(dòng)力學(xué)和心肌缺血實(shí)驗(yàn)比較亳菊總黃酮（TF）及納米乳（TF-NE）。方法：采用DPPH法測定亳菊總黃酮清除自由基的能力；采用腹腔注射STZ制備大鼠糖尿病模型，觀察亳菊總黃酮對(duì)糖尿病大鼠凝血時(shí)間，體外血栓長度及干、濕重，全血和血漿粘度，紅細(xì)胞壓積和紅細(xì)胞沉降速率，以及血清一氧化氮（NO）含量的影響。采用HPLC梯度洗脫，同時(shí)測定亳菊總黃酮中三種黃酮苷元成分；制備成亳菊總黃酮納米制劑，建立了測定大鼠生物樣本處理和測定的方法學(xué)，并對(duì)TF、TF-NE進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)研究。采用冠脈結(jié)扎法建立大鼠心肌缺血模型，測定血清酶（AST、LDH、CK）活性、凝血時(shí)間以及梗死率，比較亳菊總黃酮與納米乳的差異。結(jié)果：亳菊總黃酮具有較強(qiáng)的抗DPPH自由基作用；亳菊總黃酮能顯著延長糖尿病大鼠凝血時(shí)間，降低體外血栓長度和干、濕重，降低紅細(xì)胞壓積，減慢紅細(xì)胞沉降速率，升高血清NO含量；實(shí)現(xiàn)了RP-HPLC同時(shí)測定亳菊總黃酮中木犀草素、芹菜素和金合歡素3種黃酮苷元成分；對(duì)亳菊總黃酮納米乳進(jìn)行表征，其平均粒徑在83.16±12.03nm，zeta電位為-（11.62±6.38）mV，粒徑范圍較窄，體系較穩(wěn)定；經(jīng)透射電鏡(TEM)對(duì)TF-NE進(jìn)行形貌觀察，制劑成球形或類球形，粒徑分布較均勻，無粘連。大鼠灌胃TF-NE與TF-相比，血漿中木犀草素和芹菜素的Tmax都有所推后、吸收半衰期和消除半衰期一定程度的延長、峰濃度Cmax有一定的增加，TF-NE中木犀草素的AUC是原料藥的2.52倍，納米乳中芹菜素的AUC是原料藥的3.62倍；木犀草素和芹菜素的相對(duì)生物利用度分別為313%和318%。與模型組相比，灌胃TF與TF-NE大鼠血清酶（AST、LDH、CK）活性都有所降低、凝血時(shí)間延長、梗死率也有降低，但TF組與TF-NE之間無明顯差異。結(jié)論：亳菊總黃酮具有抗自由基、抗氧化、改善糖尿病大鼠血液流變學(xué)異常的作用。首次采用有效部位——亳菊總黃酮作為藥物做成納米制劑，并使用多指標(biāo)成分做指標(biāo)來進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。納米乳能提高總黃酮的生物利用度，TF與TF-NE均具有對(duì)抗大鼠急性心肌缺血的作用。 

前 言

隨著人們生活水平及質(zhì)量的不斷提高，人民的飲食結(jié)構(gòu)的改變，心腦血管疾病的發(fā)病率也呈上升趨勢。其危害人類尤其是中老年人的健康，死亡率居各種疾病之首。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)調(diào)查，我國由心腦血管引起的死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的40%左右，藥品市場半數(shù)藥物為心血管病。因此對(duì)治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥品與保健品的開發(fā)研究就顯得尤為重要。
心肌缺血易引發(fā)缺血性心臟病，常伴有血液流變性異常[1]。心肌缺血易引起心肌細(xì)胞溶解死亡以及自律性細(xì)胞節(jié)律的改變，還會(huì)出現(xiàn)血漿中酶含量變化。當(dāng)心肌缺血在短時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生心肌頓抑；血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)使血管栓塞、官腔狹窄，從而引起冠脈堵塞，易引起心肌缺血、缺氧。心臟血液流動(dòng)如果不暢，就沒有足夠的氧和營養(yǎng)物質(zhì)來維持心臟組織的活力。持續(xù)一段時(shí)間后會(huì)引發(fā)心肌梗死、心律失常等癥狀。而心肌梗塞會(huì)伴有血液流變學(xué)的異常改變，表現(xiàn)為血液、血漿的粘度升高，血沉和壓積的增加、紅細(xì)胞聚集性增加、以及血小板聚集，以致血液循環(huán)阻力增加，造成心肌供血不足，嚴(yán)重的可以造成組織細(xì)胞壞死。
氧化反應(yīng)廣泛存在，自由基是生物體在新陳代謝時(shí)奪走氧原子中的電子，使氧原子變成自由基，能夠攻擊細(xì)胞組織中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類和 DNA 等物質(zhì)，通過奪取失去的電子達(dá)到新平衡，細(xì)胞分子失去電子后又形成新的自由基，造成連鎖反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜、遺傳因子等的損傷，從而引發(fā)嚴(yán)重的疾病。此外，自由基含脂類成分食品酸敗——脂質(zhì)過氧化，使油脂營養(yǎng)喪失，并損害生物膜、蛋白質(zhì)與活細(xì)胞功能，這些產(chǎn)物中有些還是公認(rèn)的致癌物。許多疾病的產(chǎn)生都與氧化有一定的關(guān)系，血液成分中的一些物質(zhì)能氧化成為過氧化物質(zhì)，經(jīng)小腸吸收，通過血液等途徑流入機(jī)體的組織中產(chǎn)生有害作用。尤其是過氧化脂質(zhì)會(huì)損傷血管細(xì)胞內(nèi)壁，阻礙血液的循環(huán)，從而導(dǎo)致腦出血、動(dòng)脈硬癥狀的產(chǎn)生。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)易損傷細(xì)胞膜與局部組織，自由基還能抑制前列腺素的合成引發(fā)血栓，通過形成脂褐素使細(xì)胞老化。為了加強(qiáng)防御系統(tǒng)，減少氧化傷害，就必須從體外補(bǔ)充一些抗氧化物質(zhì)，如食品類抗氧化成分有維生素 C、維生素 E 等；天然抗氧劑有黃酮類、苯酚類、鞣質(zhì)類、皂苷類等。經(jīng)證實(shí)合成抗氧化劑有致癌作用，由于天然的抗氧成分來源廣泛、安全健康，因此從天然產(chǎn)物中尋找更加安全有效的抗氧化劑成為更多國內(nèi)外學(xué)者的共同研究的對(duì)象。
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第一章 亳菊總黃酮藥效學(xué)的初步評(píng)價(jià)

第一節(jié) DPPH法測定亳菊總黃酮的抗氧化活性
采用 DPPH 法測定亳菊總黃酮的抗氧化作用。DPPH 在有機(jī)溶液中是一種穩(wěn)定的自由基，該溶液特征是紫紅色團(tuán)的吸收峰，具有極強(qiáng)的氧化性。采用比色法測定 DPPH 的吸光度，以加入亳菊總黃酮溶液使其吸光度在 517nm 下的吸光度下降的影響來確定黃酮溶液對(duì) DPPH 的清除能力，以清除率表示[19-24]。測定自由基的清除作用，可以反映其抗氧化活性。經(jīng)測定結(jié)果顯示亳菊總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)其進(jìn)一步研究保護(hù)體內(nèi)局部區(qū)域損傷提供依據(jù)。
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1 儀器與材料
1.1 儀器
UV-757CRT 紫外分光光度計(jì)(上海棱光儀器有限公司)；CP-225D 電子分析天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；HH-S2 恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠制造）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；DZF-200 型真空干燥箱（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠）；KP3200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 材料
亳菊總黃酮（自制，總黃酮含量為 76.3%）；DPPH(1，1－二苯基苦基苯肼)（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào) 00909，純度 HPLC≧98%）；蘆丁對(duì)照品（自制，純度 HPLC≧98%）；甲醇（MeOH）、乙醇(EtOH)為分析純；水為重蒸餾水。
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第二章 亳菊總黃酮的質(zhì)量控制及納米乳的制備............... 30-44 
第一節(jié) 總黃酮原料藥的質(zhì)量控制 ...................30-39 
1 儀器與材料................ 30 
2 方法和結(jié)果 .................................30-37 
3 討論 .............................37 
4 小結(jié) ..........................37-39 
第二節(jié) 亳菊總黃酮納米乳的制備與質(zhì)量評(píng)價(jià) ................39-44 
1 儀器與材料....................................... 39 
2 方法和結(jié)果 ..........................39-42 
3 討論............................ 42-43 
4 結(jié)論............................. 43-44 
第三章 亳菊總黃酮與納米乳制劑代動(dòng)力學(xué)比較研究............... 44-60 
1 儀器與材料.......................... 44 
2 方法和結(jié)果 ...........................44-58 
3 討論......................... 58 
4 結(jié)論............................... 58-60 

第四章 亳菊總黃酮及其納米乳制劑抗急性心肌缺血實(shí)驗(yàn)

比較亳菊總黃酮及其納米制劑的對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用。采用冠脈結(jié)扎法建立心肌缺血大鼠模型，對(duì)比大鼠灌胃 TF 及其 TF-NE 心電圖、血清心肌酶（AST、LDH、CK）含量、TTC 染色測定梗死率及凝血時(shí)間（PT、APTT）的差異。TF 及其 TF-NE 能對(duì)抗冠脈結(jié)扎引發(fā)大鼠急性心肌缺血模型的心電圖 ST 段的抬高，降低血清心肌酶（AST、LDH、CK）活性，明顯縮短凝血時(shí)間。但 TF 與 TF-NE 之間無明顯差異。
1 儀器與材料
1.1 儀器
XD-7100 型單道心電圖機(jī)（上海醫(yī)用電子儀器廠），恒溫水浴鍋。
1.2 藥品與試劑
亳菊總黃酮（自制，，總黃酮含量為 76.3%）；紅四氮唑（TTC，BIOSHARP 公司，批號(hào)：0765）；復(fù)方丹參滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，批號(hào)：110361）。
1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
Wistar 大鼠(購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄各半，體重 200~220g，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)。
2 方法與結(jié)果
2.1 動(dòng)物分組與給藥
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為 5 組，隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、陽性組（復(fù)方丹參滴丸，140mg/kg）、亳菊總黃酮（TF）組（400mg/kg）、亳菊總黃酮納米乳（TF-NE）組（400mg/kg）每組 14 只。術(shù)前連續(xù) 7 天灌胃給藥，每天 1 次共 7 天。各組動(dòng)物按劑量灌胃給藥，按體重給予相應(yīng)體積，假手術(shù)組、模型組給予 10mL/kg 等容量的0.5%CMC-Na 溶液。
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總結(jié)

通過DPPH法實(shí)驗(yàn)證明了菊花總黃酮有清除DPPH自由基作用，本法操作簡單，快速，準(zhǔn)確，用樣量小，為研制天然抗氧化劑以及深入研究藥理作用提供依據(jù)。
通過大鼠血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn)，明確亳菊總黃酮降低體外血栓長度和干、濕重，降低紅細(xì)胞壓積，減慢紅細(xì)胞沉降速率，升高血清 NO 含量。因此亳菊總黃酮能夠改善大鼠血液流變學(xué)異常。
建立心肌缺血模型，初步確定亳菊總黃酮對(duì)冠脈結(jié)扎所致的心肌缺血具有保護(hù)作用。
對(duì)亳菊總黃酮原料藥進(jìn)行質(zhì)量控制，HPLC同時(shí)測定其中的三種黃酮苷元成分——木犀草素、芹菜素、金合歡素，并制備了亳菊總黃酮納米制劑。同時(shí)進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃后納米乳兩種苷元成分不同的劑型藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)有變化，峰值Cmax有一定增加，達(dá)峰時(shí)間Tmax、血藥濃度維持時(shí)間分別延長，曲線下面積有所增加，生物利用度有不同程度的提高。
通過心肌缺血模型實(shí)驗(yàn)對(duì)比亳菊總黃酮及其納米制劑，研究使用冠脈結(jié)扎法引發(fā)心肌缺血模型，以心電圖ST段的抬高顯示心肌缺血模型的建立，以手術(shù)后ST段降低程度反映藥物對(duì)心肌損傷的保護(hù)能力，以心肌酶指標(biāo)判斷心肌的傷程度，以梗塞率確定藥物降低心肌細(xì)胞壞死的能力。證明亳菊總黃酮及其納米乳對(duì)大鼠急性心肌缺血模型有不同程度的保護(hù)作用。
藥效學(xué)初步評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，所做的血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn)中總黃酮的濃度是參照相關(guān)的文獻(xiàn)暫定的劑量為30，60，120mg/kg。而后來實(shí)驗(yàn)過程考慮到藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)初步采用了TF-NE的最大載藥量為400mg/kg，因此心肌缺血藥理實(shí)驗(yàn)同樣采用相同的劑量400mg/kg。
菊總黃酮具有抗自由基、抗氧化、改善糖尿病大鼠血液流變學(xué)異常的作用。首次采用有效部位——亳菊總黃酮作為藥物做成納米制劑，并使用多指標(biāo)成分做指標(biāo)來進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。納米乳能提高總黃酮的生物利用度，TF與TF-NE均具有對(duì)抗大鼠急性心肌缺血的作用。
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參考文獻(xiàn)（略）