本文選題：乳腺癌 + 槐耳清膏�。� 參考：《湖北中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類身體健康的疾病,隨著當(dāng)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究也隨之進(jìn)步,人們已經(jīng)充分認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜的生物學(xué)過程。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重影響了女性身心健康。近年來乳腺癌已成為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年升高趨勢,且有年輕化傾向。乳腺癌的治療以手術(shù)為主,術(shù)后輔助放化療雖可改善患者的總生存和無病生存率,但易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。蒽環(huán)類/紫杉醇類化療藥物的先后問世,是乳腺癌內(nèi)科治療的一次重大突破,使乳腺癌的治愈率進(jìn)一步得到了提高,但由于臨床上一線和二線的廣泛使用,大大增加了蒽環(huán)類及紫衫類藥物的耐藥性。盡管新的藥物在不斷涌現(xiàn),但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療效果并不理想,曲妥珠單抗使HER2過表達(dá)乳腺癌患者能夠獲益,但治療效果很有限。目前有關(guān)藥物防治乳腺癌的效果尚不理想,或因毒副作用限制了其臨床使用,中草藥由于具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡作用,能增強(qiáng)患者生活質(zhì)量和抗病能力,減少因手術(shù)、放化療等損傷性治療給患者帶來的不良反應(yīng),而且其毒副反應(yīng)小,價(jià)格低廉,因此從中草藥中尋找具有抗乳腺癌的天然生理活性物質(zhì)或先導(dǎo)化合物并了解其抗腫瘤作用的機(jī)制具有十分重要意義。槐耳是一種生長在古槐樹上的藥用真菌——槐栓菌,早在1500多年前就已經(jīng)被作為藥物用于治療各種疾病,其功效主要有止血、止痢、抗癌、崩漏、痢疾、肝炎等�；倍甯酁檎婢倍|(zhì)發(fā)酵后的熱水提取產(chǎn)物,其主要抗癌活性成分為槐耳蛋白多糖(PS-T),含有多種有機(jī)成分和礦物質(zhì)元素,具有扶正固本,活血化瘀作用。能誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,改善患者生活質(zhì)量,同時(shí)對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移也具有一定的抑制效果,在乳腺癌的治療中發(fā)揮著非常重要的作用。本課題以乳腺癌細(xì)胞系為研究對象,探討槐耳清膏對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。從micro RNA水平研究槐耳清膏對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制,觀察抑癌基因mi R-126的變化,進(jìn)一步“尋本溯源”,探討其對SOX2蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建裸鼠異種乳腺癌移植瘤模型,研究槐耳清膏對MCF-7細(xì)胞致瘤性的影響,從而為臨床槐耳清膏治療乳腺癌提供理論依據(jù)。觀察槐耳顆粒聯(lián)合化療與單純化療在治療乳腺癌術(shù)后患者的生活質(zhì)量和免疫功能的影響,為臨床推廣應(yīng)用及進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。方法1.將處于對數(shù)生長期的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞各加入3mg/m L、6mg/m L、9mg/m L的槐耳清膏處理48小時(shí),用MTT比色法測定OD值,計(jì)算其抑制率,同時(shí)觀察細(xì)胞周期變化;流式細(xì)胞儀檢測槐耳清膏對凋亡的影響;熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。2.槐耳清膏處理后的MCF-7細(xì)胞,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測與乳腺癌相關(guān)的mi RNA表達(dá)普情況;PCR測定槐耳清膏作用于MCF-7細(xì)胞后,mi R-126的表達(dá)水平;MTT檢測槐耳清膏對轉(zhuǎn)染了mi R-126 inhibitor的MCF-7細(xì)胞的增殖情況;生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合文獻(xiàn)查閱提示SOX2可能是mi R-126的靶基因,并采用PCR對靶基因m RNA表達(dá)進(jìn)行測定,運(yùn)用Western-Blot檢測SOX2蛋白的表達(dá)水平。3.將裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,實(shí)驗(yàn)組給予槐耳清膏灌胃(濃度150mg/m L),每次灌胃0.2m L,每天兩次,共30天。對照組:每只裸鼠每次灌胃0.9%生理鹽水0.2m L,每天兩次,共30天。觀察裸鼠瘤體積及瘤體重的變化,顯微鏡觀察移植瘤組織病理變化特點(diǎn),并運(yùn)用q RT-PCR檢測兩組裸鼠移植瘤組織中mi R-126表達(dá)的差異。4.經(jīng)病理學(xué)檢查確診的乳腺癌術(shù)后患者90例,隨機(jī)分為兩組,治療組:應(yīng)用“FEC”方案化療(環(huán)磷酰胺0.6/m2,靜脈推注,d1,表阿霉素100mg/m2,靜脈滴注,d1,5-氟尿嘧啶0.6/m2,靜脈滴注,d1),同時(shí)口服槐耳顆粒,20克/次,3次/日,21天為一周期;對照組單純行“FEC”方案化療,化療前后測定兩組患者外周血NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值,并觀察生活質(zhì)量的變化。結(jié)果1.MTT法檢測不同濃度槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞48h后的抑制率,與陰性對照組比較,各濃度組的OD值呈逐漸下降,在槐耳清膏濃度為3、6、9mg/m L時(shí)其細(xì)胞抑制率分別為(17.4±1.4)%、(58.6±3.7)%、(76.1±2.9)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。槐耳清膏作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞48h后,與陰性對照組比較,各濃度組的OD值變化不大,在槐耳清膏濃度為3、6、9mg/m L時(shí)其細(xì)胞抑制率分別為(10.3±1.7)%、(15.1±2.6)%、(17.8±3.9)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同濃度槐耳清膏作用于MCF-7細(xì)胞48h后,早期凋亡比率分別為25.4%、39.1%和50.6%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而晚期凋亡比率分別為6.27%、7.58%和8.04%,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。不同濃度槐耳清膏作用于MDA-MB-231細(xì)胞48h后,早期凋亡比率分別為1.44%、1.79%和1.56%,晚期凋亡比率分別為5.54%、7.62%和7.99%,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�；倍甯喔鳚舛冉M與MCF-7細(xì)胞作用后均可發(fā)生細(xì)胞增殖抑制,各濃度組作用24h后細(xì)胞抑制率分別為(10.7±3.8)%、(42.6±4.3)%、(54.9±4.6)%,作用36h后分別為(15.4±2.2)%、(47.9±5.4)%、(62.7±1.5)%,作用48h后分別為(17.4±1.4)%、(58.6±3.7)%、(76.1±2.9)%,陰性對照組細(xì)胞增殖抑制率分別為(2.8±1.3)%、(2.6±1.5)%、(3.1±1.2)%,槐耳清膏各濃度組與對照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。通過MTT來測定細(xì)胞周期分布情況,槐耳清膏不同濃度組處于G0/G1期細(xì)胞比例分別為59.62%、62.19%、65.84%,分布于S期細(xì)胞比例分別為15.74%、13.18%、10.94%,分布于G2/M期細(xì)胞比例分別為24.64%、24.63%、23.22%,而對照組分布于G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比例分別為44.52%、21.87%、33.61%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。熒光顯微鏡下觀察經(jīng)槐耳清膏處理48h后的MCF-7細(xì)胞,可見部分細(xì)胞核膜皺縮,核變小,染色質(zhì)濃聚,熒光明顯增強(qiáng),呈亮藍(lán)色大小不等的碎片狀,并可出現(xiàn)濃縮且邊緣聚集分布,細(xì)胞邊緣不太完整,細(xì)胞核內(nèi)可出現(xiàn)濃染致密的熒光顆粒,細(xì)胞核可見新月形改變,固縮或片段的核,證明細(xì)胞發(fā)生了凋亡;而對照組細(xì)胞核染色體多呈橢圓形,內(nèi)有染色較淡的藍(lán)色顆粒,邊緣完整清晰。2.在槐耳清膏處理后的乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞中檢測與乳腺癌相關(guān)的mi RNA表達(dá)譜的情況,發(fā)現(xiàn)在MCF-7細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)的mi RNA分別有6個(gè)和21個(gè),在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)的mi RNA分別有3個(gè)和24個(gè),mi R-21-5p在MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞被同時(shí)上調(diào),有20個(gè)mi RNA被同時(shí)下調(diào)。但在MCF-7細(xì)胞中,上調(diào)大于2倍的mi RNA有mi R-7-5p、mi R-21-5p、mi R-126-3p,其中mi R-126上調(diào)最為明顯。結(jié)合前期槐耳清膏對MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡影響顯著,所以我們選擇經(jīng)槐耳清膏處理后的MCF-7細(xì)胞中,發(fā)生上調(diào)的mi R-126作進(jìn)一步研究�；倍甯嘧饔糜趯�(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后,我們采用RT-PCR的相對定量法來檢測mi R-126的相對表達(dá)量,結(jié)果顯示,3mg/m L、6mg/m L和9mg/m L分別是對照組的1.44倍、2.88倍和2.51倍。轉(zhuǎn)染mi R-126 inhibitor或inhibitor control 48h后,通過比較OD490值檢測細(xì)胞的存活情況。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染了mi R-126 inhibitor或inhibitor control的MCF-7細(xì)胞同時(shí)用6mg/ml的槐耳清膏處理48h,通過比較OD490值檢測細(xì)胞的存活情況,發(fā)現(xiàn)槐耳清膏抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用明顯被削弱。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染p RL-TK-SOX2-3’UTR-WT/p RL-TK-SOX2-3’UTR-Mut,Control/mi R-126 mimic及內(nèi)對照質(zhì)粒p GL3,48h后進(jìn)行報(bào)告基因檢測,共轉(zhuǎn)染p RL-TK-SOX2-3’UTR-WT、mi R-126 mimic和p GL3質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯低于對照組,而在p RL-TK-SOX2-3’UTR-Mut、mi R-126 mimic和p GL3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組中熒光強(qiáng)度與對照組無差異。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染Control/mi R-126 mimic 24h和48h后,分別提取MCF-7 RNA和蛋白檢測SOX2 m RNA和SOX2蛋白的表達(dá)情況,與對照組比較,mi R-126mimic轉(zhuǎn)染組能明顯抑制SOX2 m RNA及蛋白的表達(dá)水平。3.在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中,每只裸鼠在接種MCF-7細(xì)胞3周后,接種部位均長出腫瘤,成瘤率100%,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后槐耳清膏灌胃組與生理鹽水灌胃組移植瘤重分別為0.20±0.07g和0.57±0.32g,實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤體重明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),移植瘤體積分別為0.32±0.74cm3與0.84±0.62 cm3,實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積較對照組小,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。肉眼觀察瘤體呈圓形、橢圓形或分葉狀包塊,質(zhì)地偏硬,包膜完整,與周圍組織大多分界清楚,切面呈灰白色。HE染色,實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤鏡下可見腫瘤組織細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的退行性變,中央及邊緣細(xì)胞出現(xiàn)大片缺血壞死區(qū),在血供較豐富的區(qū)域表現(xiàn)尤為明顯,而在壞死灶周圍可見殘存的腫瘤細(xì)胞。對照組細(xì)胞生長旺盛,有異型性,形態(tài)不規(guī)則,大小不等,細(xì)胞核大、濃染,可見病理性核分裂相,無明顯壞死區(qū)。實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤組織中表達(dá)明顯高于對照組,實(shí)驗(yàn)組mi R-126的相對表達(dá)量是對照組的2.406倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.90例乳腺癌術(shù)后患者,隨機(jī)分為治療組和對照組,治療組化療聯(lián)合槐耳顆�？诜�,對照組單純行化療,兩組患者在治療前查外周血NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值,分別為(14.73±5.21)%、(55.24±4.36)%、(35.87±4.29)%、(25.34±4.36)%、(1.14±0.35)%與(14.25±4.88)%、(56.21±4.57)%、(35.58±3.17)%、(24.26±3.16)%、(1.16±0.43)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。治療2周期后查外周血NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值,分別為(22.74±5.09)%、(65.71±3.95)%、(41.95±6.27)%、(23.72±2.47)%、(1.47±0.26)%與(14.94±5.21)%、(55.34±5.43)%、(34.46±3.25)%、(23.83±3.44)%、(1.12±0.37)%,治療組治療后NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值明顯高于治療前,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但CD8+值變化不大,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而對照組各項(xiàng)指標(biāo)在治療前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),治療后各項(xiàng)免疫指標(biāo)較治療前下降。治療組在患者治療后NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值均高于對照組患者治療后相應(yīng)各項(xiàng)指標(biāo),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但CD8+值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在生活質(zhì)量評分中,治療組KPS評分提高22例(48.89%)、穩(wěn)定20例(44.44%)、下降3例(6.67%),提高率為48.89%,而對照組KPS評分提高7例(15.56%)、穩(wěn)定33例(73.33%)、下降5例(11.11%),提高率為15.56%,治療組提高率高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.槐耳清膏對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長,這種抑制效果更明顯;槐耳清膏能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡,具有明顯的藥物濃度和時(shí)間的量效關(guān)系;槐耳清膏對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞無明顯的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用。2.槐耳清膏能上調(diào)MCF-7細(xì)胞中mi R-126的表達(dá),上調(diào)的mi R-126可通過抑制靶基因SOX2蛋白的表達(dá)參與到槐耳清膏抑制MCF-7細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用中,上述研究發(fā)現(xiàn)為槐耳清膏的抗腫瘤作用提供了新的分子機(jī)制。3.在裸鼠體內(nèi),槐耳清膏能抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的成瘤性,其機(jī)制可能是槐耳清膏能上調(diào)mi R-126的表達(dá),從而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞生長的作用。4.槐耳顆粒能提高乳腺癌術(shù)后化療患者NK細(xì)胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值,但CD8+值變化不大,證明槐耳顆粒具有良好的免疫增強(qiáng)效果,能增強(qiáng)乳腺癌術(shù)后化療患者的免疫力,改善生活質(zhì)量,值得臨床進(jìn)一步研究。通過細(xì)胞研究、動物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察,發(fā)現(xiàn)槐耳清膏通過上調(diào)mi R-126的表達(dá),進(jìn)一步調(diào)控靶基因SOX2蛋白水平,從而影響乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R273
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本文編號：1731524