本文選題：栝樓桂枝湯　切入點：腦卒中后肌肉痙攣　出處：《福建中醫(yī)藥大學》2016年博士論文

【摘要】：背景：腦卒中,具有患病率高、致殘率高、死亡率高等特點。腦卒中后肌肉痙攣是其常見的后遺癥,嚴重影響患者的康復和日常生活能力。目前臨床上針對腦卒中后肌肉痙攣的藥物,相對匱乏。中醫(yī)對中風病的認識源遠流長,在治療慢性、多因素的復雜疾病中顯示出良好的療效優(yōu)勢。栝樓桂枝湯,處方來源于《金匱要略》卷上,由栝樓、白芍、桂枝、生姜、甘草及大棗六味藥物組成,具有解肌祛邪,舒緩筋脈。主治太陽柔痙體強證。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn),栝樓桂枝湯對治療中風后肢體痙攣有較好的療效,然而其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本課題獲得了福建省科技廳重點項目(項目編號：2012Y0041)的支持。目的：本課題旨在闡釋栝樓桂枝湯治療腦卒中后肌肉痙攣的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),探討其腦靶向優(yōu)勢,為復方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和腦源性疾病的多靶點治療提供有力的科學數(shù)據(jù)支持。方法：(1)采用液質(zhì)聯(lián)用方法,對栝樓桂枝湯中的兩種氨基酸(瓜氨酸和Y-氨基丁酸)及其他24種活性成分進行分析、測定。(2)采用大腦中動脈栓線阻斷法制備局灶性腦缺再灌注損傷模型(MCAO),缺血2h后進行再灌注,分析測定MCAO模型大鼠的神經(jīng)行為學、腦梗塞面積、病理組織形態(tài)、腦脊液內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化,探討栝樓桂枝湯治療腦卒中后肌肉痙攣的藥效作用。(3)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)方法,分析檢測栝樓桂枝湯給藥后腦缺血再灌注模型大鼠的入腦成分。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法,分析檢測栝樓桂枝湯給藥后腦缺血再灌注模型大鼠的入腦的揮發(fā)性成分。(4)采用伊文思藍染色方法,觀察給藥后BBB通透性的變化；采用免疫組織化學技術(shù),檢測腦組織中緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5、水通道蛋白AQP-4蛋白的變化；采用ELISA方法,檢測腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的變化。結(jié)果：(1)分別建立了HPLC-MS、UPLC-MS/MS法測定栝樓桂枝湯中兩種氨基酸(瓜氨酸和Y-氨基丁酸)及其他24種活性成分(沒食子酸、原兒茶酸、氧化芍藥苷、兒茶素、對羥基苯甲酸、沒食子酸甲酯、香草酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、4-羥基肉桂酸、甘草苷、紫云英苷、3-羥基肉桂酸、異甘草苷、2-羥基肉桂酸、甘草素、酸棗仁皂苷A、肉桂酸、甘草酸、6-姜酚、甘草查爾酮A、8-姜酚、6-姜烯酚、甘草次酸)的含量的測定方法。(2)藥效學結(jié)果表明,在神經(jīng)功能癥狀評分方面,栝樓桂枝湯低、中、高劑量組第7天評分低于MCAO模型組(P＜0.05)；在運動功能障礙發(fā)面,與模型組比較,栝樓桂枝湯低、中、高劑量組,功能障礙評價分數(shù)明顯升高,有顯著性差異(P＜0.05)；在腦梗死體積方面,MCAO模型組與栝樓桂枝湯中、高劑量組比較有顯著性差異(P0.05)；在腦組織病理方面,給藥組與MCAO模型組相比,病理改變明顯減輕。雖出現(xiàn)神經(jīng)元變性、壞死,組織水腫,細胞排列散亂,核溶解及胞核固縮等現(xiàn)象,但程度和數(shù)量均較MCAO模型組減少。在氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)方面,與模型組比較,栝樓桂枝湯高劑量組能降低腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸)含量。(3)通過UPLC-MS方法,在灌胃給藥后模型大鼠的腦脊液和腦組織中鑒定出11個成分(瓜氨酸、沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸)；通過GC-MS方法,在栝樓桂枝湯復方中共鑒別93個揮發(fā)性成分,并初步鑒定出54個揮發(fā)性入腦成分。(4)在腦組織EB含量方面,與MCAO模型組相比,栝樓桂枝湯組的腦組織EB含量降低(P＜0.01)。免疫組化結(jié)果表明；Zo-1、Claudin-5、AQP-4陽性主要定位在胞漿中,模型組中Zo-1、Claudin-5的表達顯著低于假手術(shù)組(P0.01),模型組中AQP-4蛋白的表達顯著高于假手術(shù)(P0.01),而栝樓桂枝湯組Zo-1、Claudin-5表達均顯著高于模型組(PD.D1),AQP-4蛋白的表達顯著低于模型組(P0.01)；在MMP-2、MMP-9含量方面,與假手術(shù)組比較,模型組MMP-2、MMP-9含量顯著增加(P＜0.01,P＜0.001)；與模型組比較,栝樓桂枝湯MMP-2、MMP-9含量顯著降低(P＜0.01,P＜0.001)。結(jié)論：(1)本文建立的HPLC-MS、UPLC-MS/MS法分別測定栝樓桂枝湯中兩種氨基酸(瓜氨酸和Y-氨基丁酸)及其他24種活性成分的方法,分析時間短、檢測靈敏度高,可為復方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定扎實的基礎(chǔ)。(2)栝樓桂枝湯能降低MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能缺損、改善運動功能障礙,縮小腦梗死體積、降低腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸)含量,減輕腦缺血再灌注的病理組織損傷。(3)栝樓桂枝湯中的瓜氨酸、沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸及鑒定出的54種揮發(fā)性成分,可以進入腦組織中,提示這些成分可能是復方治療腦卒中后肌肉痙攣的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。(4)栝樓桂枝湯能夠降低BBB的通透性,其作用機制可能是通過上調(diào)ZO-1、Claudin-5的表達,恢復緊密連接的功能；下調(diào)水通道蛋白AQP4的表達,抑制基質(zhì)金屬蛋白MMP-2、MMP-9,減輕缺血再灌注后腦水腫和神經(jīng)細胞損傷程度,發(fā)揮多靶點的腦保護作用,進而改善腦卒中后肌肉痙攣。
[Abstract]:Objective : To study the effect of Guizhi Tang in the treatment of post - stroke muscle spasm .
The expression of AQP - 4 protein in brain tissue was detected by immunohistochemistry , and the expression of AQP - 4 protein in brain tissue was detected .
The results showed that : ( 1 ) HPLC - MS , UPLC - MS / MS method was used to determine the contents of two kinds of amino acids ( including gallic acid , chlorogenic acid , peonionic acid , catechin , p - hydroxybenzoic acid , methyl - 4 - hydroxy cinnamic acid , vanillic acid , penonionic acid , liquiritin , 4 - hydroxy cinnamic acid , vanillic acid , penonionic acid , 6 - gingerol , 3 - hydroxy cinnamic acid , isoliquiritin , 2 - hydroxycinnamic acid , 6 - gingerol , liquiritin A , 8 - gingerol , 6 - gingerol , etc . ) .
Compared with model group , the score of functional dysfunction was significantly higher in the lower , middle and high dosage groups than in model group ( P < 0.05 ) .
There was a significant difference in the volume of cerebral infarction ( P0.05 ) .
( 3 ) In the aspect of amino acid neurotransmitters , 11 components were identified in cerebrospinal fluid and brain tissue of the model rats after the administration of stomach . ( 3 ) Compared with the model group , the high - dose group of Guizhi Tang could reduce the content of amino acid neurotransmitters ( aspartic acid , glutamic acid , glycine ) in brain tissue .
A total of 93 volatile components were identified by GC - MS , and 54 volatile components were identified . ( 4 ) The EB content in brain tissue of Guizhi decoction group decreased ( P < 0.01 ) .
Zo - 1 , Claudin - 5 , AQP - 4 were mainly located in the cytoplasm . The expression of Zo - 1 and Claudin - 5 in the model group was significantly lower than that in sham operation group ( P0.01 ) . The expression of AQP - 4 protein in the model group was significantly higher than that in sham operation group ( P0.01 ) .
Compared with sham operation group , MMP - 2 and MMP - 9 in model group increased significantly ( P & lt ; 0.01 , P & lt ; 0.001 ) .
Compared with model group , the content of MMP - 2 and MMP - 9 in Guizhi decoction decreased significantly ( P & lt ; 0.01 , P & lt ; 0.001 ) . Conclusion : ( 1 ) The HPLC - MS , UPLC - MS / MS method established in this paper can be used to determine the contents of two kinds of amino acids ( melon and Y - aminobutyric acid ) and other 24 active ingredients in Guizhi decoction of the thes kirilowii Maxim .
down - regulate the expression of AQP4 , inhibit MMP - 2 and MMP - 9 of matrix metal protein , reduce the degree of cerebral edema and nerve cell injury after ischemia and reperfusion , exert the brain protection function of multiple target points , and further improve muscle spasm after stroke .

【學位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R277.7

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本文編號：1728253