本文選題：冠心病　切入點：血瘀證　出處：《湖南中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的研究冠心病急性、慢性血瘀證及不同致瘀因素冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝的變化,探討不同發(fā)病趨勢、不同致瘀因素對基于Flux Explorer構(gòu)建的冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型的影響。方法(1)理論研究:通過對心肌能量代謝相關(guān)文獻進行研究,從理論上探討正常心肌能量代謝的特點、調(diào)節(jié)及缺血心肌能量代謝的變化,通過對與冠心病相關(guān)的中醫(yī)古籍文獻及現(xiàn)代文獻的研究,探討冠心病血瘀證形成的病因病機;通過對生物代謝網(wǎng)絡(luò)模擬研究、心血管病網(wǎng)絡(luò)模型研究及中醫(yī)證候網(wǎng)絡(luò)模型研究的現(xiàn)狀分析,探討代謝網(wǎng)絡(luò)模型研究的特點及其優(yōu)勢,為將系統(tǒng)生物學(xué)引入中醫(yī)證候本質(zhì)的研究,探討急性、慢性發(fā)病趨勢及瘀阻、痰擾、寒凝、氣滯不同致瘀因素對冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型的影響提供理論依據(jù)。(2)不同發(fā)病趨勢對心肌細胞能量代謝及網(wǎng)絡(luò)模型的影響:(1)通過高脂飼養(yǎng)+維生素D3腹腔注射結(jié)合冠脈結(jié)扎法、ISO反復(fù)連續(xù)腹腔注射法建立大鼠冠心病急性、慢性血瘀證模型,取缺血區(qū)心肌組織,采用基因芯片對冠心病急性、慢性血瘀證基因表達進行研究,通過GO分析和pathway分析篩選與能量代謝有關(guān)的差異基因及目標(biāo)通路,并選取與能量代謝相關(guān)的基因進行熒光定量RT-PCR驗證;通過ELISA方法檢測心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及HK、LDH、CACT、ACS、CS的含量;采用GC/TOF-MS平臺對冠心病急性、慢性血瘀證心肌組織代謝物進行檢測,通過多元變量統(tǒng)計分析及通路富集分析篩選差異代謝物及差異富集的代謝通路。(2)基于Flux Explorer平臺構(gòu)建冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型,采用血氣分析方法檢測冠心病急性、慢性血瘀證大鼠動脈血氧含量,結(jié)合通過GC/TOF-MS檢測的代謝物如葡萄糖、脂肪酸含量,作為能量代謝底物輸入心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型,通過FBA方法和SPA方法分析急性、慢性發(fā)病對冠心病血瘀心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型的影響。(3)不同致瘀因素對心肌細胞能量代謝及網(wǎng)絡(luò)模型的影響:(1)ISO腹腔注射結(jié)合凝血酶+氨基己酸注射法、動脈粥樣硬化斑塊法、冷凍應(yīng)激法、夾尾激怒法復(fù)制瘀阻、痰擾、寒凝、氣滯4種不同致瘀因素所致大鼠冠心病血瘀證模型,取缺血區(qū)心肌組織,采用熒光定量RT-PCR對能量代謝相關(guān)基因ME1、CPT2、ACSL1、CS、IDH3A的表達進行檢測;通過ELISA方法檢測心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及HK、LDH、CACT、ACS、CS的含量;采用GC/TOF-MS平臺對不同致瘀因素冠心病血瘀證心肌組織代謝物進行檢測,通過多元變量統(tǒng)計分析及通路富集分析篩選差異代謝物及差異富集的代謝通路。(2)基于Flux Explorer平臺構(gòu)建冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型,采用血氣分析方法檢測不同致瘀因素冠心病血瘀證大鼠動脈血氧含量,結(jié)合代謝組學(xué)檢測的葡萄糖、脂肪酸含量,三者作為能心肌細胞量代謝網(wǎng)絡(luò)模型的能量代謝底物輸入,通過FBA方法和SPA方法分析瘀阻、痰擾、寒凝、氣滯不同致瘀因素對冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型的影響。結(jié)果(1)理論研究:(1)缺血引起心肌能量代謝重構(gòu),葡萄糖、脂肪酸、糖原、乳酸等代謝途徑均發(fā)生了改變。(2)冠心病血瘀證的基本病理是心肌缺血,其發(fā)病與心肌細胞能量代謝障礙有密切關(guān)系,冠心病血瘀證病機復(fù)雜,然其基本病機是“心脈痹阻”,導(dǎo)致“心脈痹阻”的因素常有瘀阻、痰擾、寒凝、氣滯等。(3)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是由功能相關(guān)的基因群或蛋白質(zhì)群體表達異常及特異代謝組分共同構(gòu)成,將系統(tǒng)生物學(xué)引入中醫(yī)證候本質(zhì)的研究中,望更全面、更確切地揭示證候的動態(tài)發(fā)生機制。(2)不同發(fā)病趨勢對心肌細胞能量代謝及網(wǎng)絡(luò)模型的影響:(1)通過對心肌組織基因組學(xué)結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)冠心病急性、慢性血瘀證能量代謝相關(guān)的差異基因主要富集于糖代謝、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、氨基酸代謝等通路,涉及的差異基因以下調(diào)為主,熒光定量RT-PCR驗證表明基因組檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。(2)通過能量代謝途徑中關(guān)鍵酶分析,冠心病急、慢性血瘀證組Na+-K+-ATP酶活、LDH、CACT、CS含量低于健康對照組(P0.01或P0.05),ACS含量高于健康對照組(P0.01或P0.05),冠心病急性血瘀證組HK含量高于健康對照組(P0.01),慢性血瘀證組HK含量低于健康對照組(P0.01)。(3)通過心肌組織代謝組學(xué)多元變量分析,冠心病急性、慢性血瘀證組分布于不同的區(qū)域,均可與健康對照組明顯區(qū)分。差異代謝物分析顯示急性、慢性冠心病血瘀證組中均出現(xiàn)下調(diào)代謝物的包括糖類如果糖、6-磷酸葡萄糖等,脂肪酸類如油酸、亞油酸等,有機酸類如延胡索酸、琥珀酸等,氨基酸類如谷氨酸等。此外,在急性冠心病血瘀證3組中均出現(xiàn)肌酸、左旋蘋果酸和阿洛糖明顯上調(diào),在慢性冠心病血瘀證組中未見此三種差異代謝物;急性冠心病血瘀證組麥芽糖、葡萄庚糖上調(diào),而慢性血瘀證組葡萄糖出現(xiàn)下調(diào)。通路分析顯示,冠心病急性、慢性血瘀證組均涉及的差異顯著的通路包括:淀粉和蔗糖代謝,TCA循環(huán),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,氨基糖和核苷酸糖代謝,精氨酸和脯氨酸代謝。此外,急性冠心病血瘀證組差異代謝通路還包括半乳糖代謝及其他氨基酸代謝通路,慢性冠心病血瘀證組差異顯著的通路還包括包括不飽和脂肪酸生物合成,脂肪酸生物合成。(4)FBA分析提示能量代謝底物(Gluc、FA、O2)、糖酵解途徑中關(guān)鍵酶(Hk、Pfk、Pk)、脂肪酸氧化途徑中關(guān)鍵酶(FAO、FACo AT、FAcl)、三羧酸循環(huán)途徑中關(guān)鍵酶(Cs、Icdh、Od)、氧化磷酸化過程中酶(NADHd、Sdh2)及ATP的生成均呈一致變化趨勢,即健康對照組冠心病急性血瘀證組冠心病慢性血瘀證組趨勢(P0.05或P0.01)。(5)SPA分析提示Gluc、O2靈敏度變化呈健康對照組冠心病急性血瘀證組冠心病慢性血瘀證組的趨勢(P0.05或P0.01),FA靈敏度變化呈冠心病慢性血瘀證組冠心病急性血瘀證組健康對照組的趨勢(P0.05或P0.01)。(3)不同致瘀因素對心肌細胞能量代謝及網(wǎng)絡(luò)模型的影響:(1)通過對心肌能量代謝相關(guān)基因檢測分析,冠心病瘀阻心脈證組、痰阻心脈證組、氣滯心脈證組ME1、CPT2、ACSL1、CS、IDH3A均明顯低于相應(yīng)健康對照組(P0.01或P0.05),冠心病寒凝心脈證組ME1、ACSL1、IDH3A、CS顯著低于C4對照組(P0.01),CPT2兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(2)通過能量代謝途徑中關(guān)鍵酶分析,不同致瘀因素冠心病血瘀證模型組Na+-K+-ATP酶活性、CACT、CS含量明顯低于相應(yīng)健康對照組(P0.01或P0.05),且寒凝心脈證組Na+-K+-ATP酶活性、CS含量明顯低于瘀、痰、氣三組(P0.01),冠心病瘀阻心脈證組、痰阻心脈證組、氣滯心脈證組HK、ACS均明顯高于相應(yīng)健康對照組(P0.01),寒凝心脈證組HK、ACS明顯低于C3對照組(P0.01),且明顯低于瘀、痰、氣三個模型組(P0.01),痰阻心脈組、氣滯心脈組LDH明顯低于C2、C4對照組(P0.01),且寒凝心脈組LDH明顯高于瘀、痰、氣三個模型組(P0.01或P0.05)。(3)通過心肌組織代謝組學(xué)多元變量分析,冠心病不同致瘀因素模型組各自聚集分布于不同的區(qū)域,相互之間可明顯區(qū)分,且4個模型組均可與其相應(yīng)的健康對照組明顯區(qū)分。差異代謝物分析顯示參與心肌能量代謝的糖類代謝物如葡萄糖、果糖、麥芽糖在瘀阻心脈證組、寒凝心脈證組、氣滯心脈證組均上調(diào),在痰阻心脈證組下調(diào),脂肪酸類代謝物在瘀阻心脈證組上調(diào),在痰阻心脈證組、寒凝心脈證組、氣滯心脈證組均表現(xiàn)為下調(diào)。通路分析顯示,4個模型組間未發(fā)現(xiàn)共同的差異代謝通路,差異代謝物主要在碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝通路富集。(4)FBA分析提示能量代謝底物Gluc、糖酵解過程中關(guān)鍵酶含量在瘀阻心脈組、寒凝心脈組高于C1、C3對照組(P0.01),,在痰阻心脈、氣滯心脈組低于C2、C4對照組(P0.05或P0.01),能量代謝底物FA、O2以及脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化過程中的關(guān)鍵酶含量及ATP的生成均呈冠心病血瘀證不同致瘀因素模型組低于相應(yīng)對照組(P0.05或P0.01)。(5)SPA分析提示冠心病瘀阻心脈組、寒凝心脈組Gluc靈敏度高于C1、C3對照組(P0.05或P0.01),痰阻心脈證組、冠心病氣滯心脈證組Gluc靈敏度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),冠心病血瘀證不同致瘀因素4個模型組FA靈敏度明顯高于相應(yīng)對照組(P0.01),而O2靈敏度明顯低于相應(yīng)健康對照組(P0.01)。結(jié)論(1)冠心病血瘀證病機復(fù)雜,然其基本病機是“心脈痹阻”,導(dǎo)致“心脈痹阻”的因素常有瘀阻、痰擾、寒凝、氣滯,其發(fā)病與心肌細胞能量代謝障礙有密切關(guān)系。(2)冠心病急性、慢性血瘀證均可引起心肌細胞能量代謝的改變,在冠心病急性血瘀證中,心肌細胞能量代謝傾向于增加對葡萄糖的糖酵解利用,在冠心病慢性血瘀證狀態(tài)下,心肌細胞中有氧代謝、無氧代謝均減弱。(3)不同致瘀因素所致冠心病血瘀證均可引起心肌細胞能量代謝的改變,總體以糖代謝途徑增加和脂肪酸代謝途徑降低為趨勢,其中瘀阻心脈證組、寒凝心脈證組、氣滯心脈證組以糖代謝底物的攝取增多為主,痰阻心脈證組以糖酵解途徑上調(diào)為主。(4)基于Flux Explorer構(gòu)建的冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)模型總體上能夠準(zhǔn)確預(yù)測冠心病急性、慢性血瘀證及不同致瘀因素所致冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝底物、能量代謝途徑中關(guān)鍵酶的變化趨勢以及ATP生成的變化,O2含量對網(wǎng)絡(luò)模型目標(biāo)函數(shù)ATP生成有關(guān)鍵作用。
[Abstract]:鐩殑鐮旂┒鍐犲績鐥呮，

本文編號：1695378