本文選題：電針　切入點(diǎn)：肥胖　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：研究電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴對(duì)中樞條件性敲除Stat5巴胖小鼠的減肥效應(yīng)及對(duì)下丘腦和附睪脂肪全基因組基因表達(dá)譜的改變,從下丘腦STAT5-IGF1信號(hào)通路角度探討針刺減肥的多通路多靶點(diǎn)的整體調(diào)整機(jī)制,為針刺減肥的臨床應(yīng)用與推廣提供更加可靠的科學(xué)證據(jù)。方法：將周齡12周雄性Stat5fl/fl和Stat5NK0小鼠隨機(jī)編碼分成4組：Stat5fl/fl組,Stat5fl/fl+EA組,Stat5NK0組和Stat5NKO+EA組,其中Stat5fl/fl組僅固定,Stat5fl/fl+EA組固定加針刺,Stat5NK0組僅固定,Stat5NKO+EA組同樣固定加針刺。四組小鼠記錄初始體重后,取準(zhǔn)單側(cè)“后三里”、“內(nèi)庭”穴位后(雙側(cè)輪換使用)75%酒精消毒,針入2-4毫米,得氣后,接電針(韓氏電針儀HANS-200E, 0.5～1mA,2/15Hz)30分鐘,疏密波。每天1次。治療6天休息1天(休息當(dāng)天禁食6h稱量體重)為1個(gè)療程,共治療4個(gè)療程。第一部分,電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴減肥效應(yīng)的研究：首先每周定期觀察小鼠體重和攝食量的改變,采用比色法結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)量血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、血糖(Glu)以及瘦素(Leptin)的變化,運(yùn)用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining, HE)染色法光鏡下觀察分析附睪脂肪細(xì)胞的形態(tài)與大小,最后進(jìn)行冷庫抗寒實(shí)驗(yàn)和代謝籠監(jiān)測(cè)系統(tǒng)評(píng)價(jià)小鼠的代謝能力,綜合各方面來評(píng)價(jià)針刺的減肥效應(yīng)。第二部分,電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴減肥效應(yīng)的全基因組基因表達(dá)譜研究：運(yùn)用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù),結(jié)合用Tophat、Cufflinks等軟件進(jìn)行基因表達(dá)水平計(jì)算,繼用UCSC genome browser來比對(duì)基因,對(duì)樣本的分類比較用GO (Gene ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的方法。檢測(cè)Stat5fl/fl組,Stat5fl/fl+EA組,Stat5NKO組和Stat5NKO+EA組四組基因表達(dá)譜進(jìn)行深度測(cè)序及比對(duì),分析電針減肥的靶基因表達(dá)水平和信號(hào)通路。將周齡6-8周的C57BL6J野生型小鼠隨機(jī)編碼根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆纸M,IGF1注射實(shí)驗(yàn)按照數(shù)字隨機(jī)表隨機(jī)分為生理鹽水組和IGF1注射組(正向?qū)嶒?yàn))；anti-IGF1注射實(shí)驗(yàn)按照數(shù)字隨機(jī)表隨機(jī)分為生理鹽水組和anti-IGF1注射組(反向?qū)嶒?yàn))；AAV-Igfl注射實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)過表達(dá)效率然后按照數(shù)字隨機(jī)表隨機(jī)分為AAV-empty(空載)組和AAV-Igfl實(shí)驗(yàn)組。第三部分,電針對(duì)中樞條件性敲除Stat5肥胖小鼠下丘腦STAT5-IGF1信號(hào)通路的影響：首先用Western Blot法檢測(cè)Stat5fl/fl組,Stat5fl/fl+EA組,Stat5NKO組和Stat5NKO+EA組四組小鼠以及高脂誘導(dǎo)肥胖的C57BL6J野生型小鼠下丘腦中IGF1的表達(dá)。同樣定期觀察各種注射條件下小鼠體重和攝食量的改變,再檢測(cè)血清中血糖和胰島素水平的變化,然后采用IGTT (Intravenous Glucose Tolerance Test)和ITT (Insulin Tolerance Test)法檢測(cè)小鼠的糖耐量程度和胰島素敏感性,進(jìn)一步用Western Blot法檢測(cè)小鼠肝臟中胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白(包括p-IRβ /t-IRβ,p-AKT/t-AKT等)的同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附Elisa法檢測(cè)肝臟中糖元和甘油三酯的含量,最后運(yùn)用熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠下丘腦中與攝食相關(guān)基因Pomc、 Npy的表達(dá),分析電針可能起效的作用機(jī)制。結(jié)果：第一部分,從小鼠的體重、攝食量、體脂比、脂肪細(xì)胞形態(tài)大小、血清學(xué)生化指標(biāo)和抗寒代謝能力方面,電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴具有減肥作用。與Stat5fl/fl組比較,Stat5NKO組小鼠體重(P0.01)和攝食量增加(P0.05)；體脂比升高(P0.05),脂肪細(xì)胞體積增大(P0.01)；血清瘦素、血糖、甘油三脂、膽固醇水平升高(P0.01)；冷庫抗寒能力下降(P0.01)。與Stat5NKO組相比,電針能有效降低小鼠體重(P0.01)和體脂比(P0.05),減小脂肪細(xì)胞體積(P0.01)；降低了血清瘦素、血糖(P0.01)、甘油三脂、膽固醇水平(P0.05)；冷庫抗寒能力上升(P0.01)。第二部分,采用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù),通過全基因表達(dá)水平檢測(cè),電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴改變了中樞條件性敲除Stat5小鼠的基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示在下丘腦中與Stat5fl/fl組比較,Stat5NKO組有420個(gè)基因被改變,其中80%上調(diào),20%下調(diào)(P0.05),由此可見Stat5是一個(gè)負(fù)性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；與Stat5NKO組相比,電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴有405個(gè)基因被改變,其中91.4%下調(diào),僅有8.6%上調(diào)。在附睪脂肪中與Stat5fl/fl組比較,Stat5NKO組共有2153個(gè)基因被改變,其中48.6%上調(diào),51.4%下調(diào)；與Stat5NKO組相比,電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴僅有454個(gè)基因被改變,其中79.5%上調(diào),20.5%下調(diào)。在下丘腦和附睪脂肪中表達(dá)水平被改變的基因表達(dá)譜中,Stat5敲除后下丘腦和附睪脂肪中共同改變基因所涉及的信號(hào)通路有：ECM受體相互作用、PPAR信號(hào)通路、細(xì)胞黏附、甘油酯類及甘油磷酸酯類代謝。而電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴后逆轉(zhuǎn)的基因所涉及共同的信號(hào)通路除了上述改變的之外,電針還改變了與脂肪細(xì)胞及代謝直接相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子、脂肪酸代謝、細(xì)胞因子受體相互作用、花生四烯酸代謝的信號(hào)通路以及胰島素信號(hào)通路,其次有細(xì)胞黏附分子、血管平滑肌收縮、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號(hào)通路。第三部分,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胰島素信號(hào)通路在電針“足三里”、“內(nèi)庭”穴后的改變,繼用Western Blot法檢測(cè)IGF1表達(dá)確認(rèn)后發(fā)現(xiàn),與Stat5fl/fl組比較,IGF1表達(dá)升高,但電針可降低IGF1的表達(dá)；而在高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠下丘腦中IGF1的表達(dá)也升高,與中樞條件性敲除Stat5小鼠下丘腦中結(jié)果一致。進(jìn)一步探討中樞IGF1在肥胖形成過程中的作用顯示：IGF1可以促進(jìn)食欲(P0.01),與抑制下丘腦Pomc的表達(dá)相關(guān)(P0.01)；而增強(qiáng)糖耐量耐受和胰島素敏感性(P0.01),降低肝臟中甘油三酯和糖元的含量(P0.01),可能與增強(qiáng)肝臟胰島素信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)(P0.01)和提高棕色脂肪中UCP1的表達(dá)(P0.01)有關(guān)。結(jié)論：1.電針對(duì)中樞條件性敲除Stat5肥胖小鼠具有減肥作用。2.電針對(duì)中樞條件性敲除Stat5肥胖小鼠的減肥作用可能與逆轉(zhuǎn)Stat5缺失導(dǎo)致肥胖引起表達(dá)水平改變的基因譜有關(guān)。3.Igfl作為Stat5的下游靶基因可以促進(jìn)食欲,改善糖耐量,增強(qiáng)靶器官胰島素敏感性。4.針刺減肥的作用靶點(diǎn)并不是直接調(diào)控Igf1,下丘腦IGF1表達(dá)的升高可能是肥胖發(fā)生時(shí)機(jī)體代償性改變。
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【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R245

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1 洪浩;基于下丘腦STAT5-IGF1信號(hào)通路的針刺減肥作用機(jī)制研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1597848