本文選題：電針　切入點：肥胖　出處：《南京中醫(yī)藥大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：研究電針“足三里”、“內庭”穴對中樞條件性敲除Stat5巴胖小鼠的減肥效應及對下丘腦和附睪脂肪全基因組基因表達譜的改變,從下丘腦STAT5-IGF1信號通路角度探討針刺減肥的多通路多靶點的整體調整機制,為針刺減肥的臨床應用與推廣提供更加可靠的科學證據(jù)。方法：將周齡12周雄性Stat5fl/fl和Stat5NK0小鼠隨機編碼分成4組：Stat5fl/fl組,Stat5fl/fl+EA組,Stat5NK0組和Stat5NKO+EA組,其中Stat5fl/fl組僅固定,Stat5fl/fl+EA組固定加針刺,Stat5NK0組僅固定,Stat5NKO+EA組同樣固定加針刺。四組小鼠記錄初始體重后,取準單側“后三里”、“內庭”穴位后(雙側輪換使用)75%酒精消毒,針入2-4毫米,得氣后,接電針(韓氏電針儀HANS-200E, 0.5～1mA,2/15Hz)30分鐘,疏密波。每天1次。治療6天休息1天(休息當天禁食6h稱量體重)為1個療程,共治療4個療程。第一部分,電針“足三里”、“內庭”穴減肥效應的研究：首先每周定期觀察小鼠體重和攝食量的改變,采用比色法結合酶聯(lián)免疫吸附法測量血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、血糖(Glu)以及瘦素(Leptin)的變化,運用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining, HE)染色法光鏡下觀察分析附睪脂肪細胞的形態(tài)與大小,最后進行冷庫抗寒實驗和代謝籠監(jiān)測系統(tǒng)評價小鼠的代謝能力,綜合各方面來評價針刺的減肥效應。第二部分,電針“足三里”、“內庭”穴減肥效應的全基因組基因表達譜研究：運用RNA-seq高通量測序技術,結合用Tophat、Cufflinks等軟件進行基因表達水平計算,繼用UCSC genome browser來比對基因,對樣本的分類比較用GO (Gene ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的方法。檢測Stat5fl/fl組,Stat5fl/fl+EA組,Stat5NKO組和Stat5NKO+EA組四組基因表達譜進行深度測序及比對,分析電針減肥的靶基因表達水平和信號通路。將周齡6-8周的C57BL6J野生型小鼠隨機編碼根據(jù)實驗目的分組,IGF1注射實驗按照數(shù)字隨機表隨機分為生理鹽水組和IGF1注射組(正向實驗)；anti-IGF1注射實驗按照數(shù)字隨機表隨機分為生理鹽水組和anti-IGF1注射組(反向實驗)；AAV-Igfl注射實驗首先檢測過表達效率然后按照數(shù)字隨機表隨機分為AAV-empty(空載)組和AAV-Igfl實驗組。第三部分,電針對中樞條件性敲除Stat5肥胖小鼠下丘腦STAT5-IGF1信號通路的影響：首先用Western Blot法檢測Stat5fl/fl組,Stat5fl/fl+EA組,Stat5NKO組和Stat5NKO+EA組四組小鼠以及高脂誘導肥胖的C57BL6J野生型小鼠下丘腦中IGF1的表達。同樣定期觀察各種注射條件下小鼠體重和攝食量的改變,再檢測血清中血糖和胰島素水平的變化,然后采用IGTT (Intravenous Glucose Tolerance Test)和ITT (Insulin Tolerance Test)法檢測小鼠的糖耐量程度和胰島素敏感性,進一步用Western Blot法檢測小鼠肝臟中胰島素信號通路相關蛋白(包括p-IRβ /t-IRβ,p-AKT/t-AKT等)的同時用酶聯(lián)免疫吸附Elisa法檢測肝臟中糖元和甘油三酯的含量,最后運用熒光定量PCR法檢測小鼠下丘腦中與攝食相關基因Pomc、 Npy的表達,分析電針可能起效的作用機制。結果：第一部分,從小鼠的體重、攝食量、體脂比、脂肪細胞形態(tài)大小、血清學生化指標和抗寒代謝能力方面,電針“足三里”、“內庭”穴具有減肥作用。與Stat5fl/fl組比較,Stat5NKO組小鼠體重(P0.01)和攝食量增加(P0.05)；體脂比升高(P0.05),脂肪細胞體積增大(P0.01)；血清瘦素、血糖、甘油三脂、膽固醇水平升高(P0.01)；冷庫抗寒能力下降(P0.01)。與Stat5NKO組相比,電針能有效降低小鼠體重(P0.01)和體脂比(P0.05),減小脂肪細胞體積(P0.01)；降低了血清瘦素、血糖(P0.01)、甘油三脂、膽固醇水平(P0.05)；冷庫抗寒能力上升(P0.01)。第二部分,采用RNA-seq高通量測序技術,通過全基因表達水平檢測,電針“足三里”、“內庭”穴改變了中樞條件性敲除Stat5小鼠的基因表達譜。結果顯示在下丘腦中與Stat5fl/fl組比較,Stat5NKO組有420個基因被改變,其中80%上調,20%下調(P0.05),由此可見Stat5是一個負性的轉錄調節(jié)因子；與Stat5NKO組相比,電針“足三里”、“內庭”穴有405個基因被改變,其中91.4%下調,僅有8.6%上調。在附睪脂肪中與Stat5fl/fl組比較,Stat5NKO組共有2153個基因被改變,其中48.6%上調,51.4%下調；與Stat5NKO組相比,電針“足三里”、“內庭”穴僅有454個基因被改變,其中79.5%上調,20.5%下調。在下丘腦和附睪脂肪中表達水平被改變的基因表達譜中,Stat5敲除后下丘腦和附睪脂肪中共同改變基因所涉及的信號通路有：ECM受體相互作用、PPAR信號通路、細胞黏附、甘油酯類及甘油磷酸酯類代謝。而電針“足三里”、“內庭”穴后逆轉的基因所涉及共同的信號通路除了上述改變的之外,電針還改變了與脂肪細胞及代謝直接相關的脂肪細胞因子、脂肪酸代謝、細胞因子受體相互作用、花生四烯酸代謝的信號通路以及胰島素信號通路,其次有細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號通路。第三部分,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)胰島素信號通路在電針“足三里”、“內庭”穴后的改變,繼用Western Blot法檢測IGF1表達確認后發(fā)現(xiàn),與Stat5fl/fl組比較,IGF1表達升高,但電針可降低IGF1的表達；而在高脂誘導的肥胖小鼠下丘腦中IGF1的表達也升高,與中樞條件性敲除Stat5小鼠下丘腦中結果一致。進一步探討中樞IGF1在肥胖形成過程中的作用顯示：IGF1可以促進食欲(P0.01),與抑制下丘腦Pomc的表達相關(P0.01)；而增強糖耐量耐受和胰島素敏感性(P0.01),降低肝臟中甘油三酯和糖元的含量(P0.01),可能與增強肝臟胰島素信號通路中相關蛋白的表達(P0.01)和提高棕色脂肪中UCP1的表達(P0.01)有關。結論：1.電針對中樞條件性敲除Stat5肥胖小鼠具有減肥作用。2.電針對中樞條件性敲除Stat5肥胖小鼠的減肥作用可能與逆轉Stat5缺失導致肥胖引起表達水平改變的基因譜有關。3.Igfl作為Stat5的下游靶基因可以促進食欲,改善糖耐量,增強靶器官胰島素敏感性。4.針刺減肥的作用靶點并不是直接調控Igf1,下丘腦IGF1表達的升高可能是肥胖發(fā)生時機體代償性改變。
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【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R245

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1 洪浩;基于下丘腦STAT5-IGF1信號通路的針刺減肥作用機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2016年

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本文編號：1597848