本文選題：腎病綜合征　切入點(diǎn)：真武湯　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：腎病綜合征(Nephrotic syndrome, NS)為兒童多發(fā)難治性疾病,發(fā)病率高達(dá)2-10/100000,為僅次于急性腎小球腎炎的第二大腎臟疾病,嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。NS病理分型復(fù)雜多樣,臨床診斷及治療難度大,一線(xiàn)用藥主要為糖皮質(zhì)激素類(lèi)免疫抑制劑,但激素治療存在復(fù)發(fā)、激素抵抗及長(zhǎng)期用藥副作用等問(wèn)題,因此,探討NS發(fā)病機(jī)制,尋找安全有效的NS治療藥物具有重要意義。真武湯為《傷寒論》中溫陽(yáng)利水的代表方劑,臨床廣泛應(yīng)用于慢性腎病的治療,在NS治療中取得一定療效。AQP2在腎臟水鈉代謝平衡和腎小管功能中具有重要作用,為水液代謝紊亂相關(guān)疾病治療的關(guān)鍵病理基礎(chǔ),為NS治療的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)；研究發(fā)現(xiàn)miRANs在維持腎臟穩(wěn)態(tài)中具有核心調(diào)節(jié)作用,同時(shí)也是AQP2潛在的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。本課題以AQP2及miRNA為切入點(diǎn),探討AQP2及miRNAs在NS發(fā)病中的參與機(jī)制,并利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)手段,體外功能獲得及缺失實(shí)驗(yàn)篩選NS發(fā)病中調(diào)控AQP2表達(dá)的miRNA,以此探討NS發(fā)病機(jī)制及真武湯治療NS的作用機(jī)理。方法：1.真武湯對(duì)阿霉素NS大鼠的治療作用研究采用一次性尾靜脈注射阿霉素(6.0mg/kg)制備阿霉素NS大鼠模型,造模一周后,給予真武湯高(16.8g·kg-1·d-1)、低(8.4 g·kg-1·d-1)治療,連續(xù)給藥四周。通過(guò)測(cè)定24h尿蛋白、血清蛋白、血脂、血肌酐、血清尿素氮及腎臟病理(HE染色病理檢查,電鏡檢查)評(píng)價(jià)真武湯對(duì)NS的治療作用；并測(cè)定血漿SOD, MDA水平以及腎組織炎癥因子水平,探討真武湯對(duì)NS氧化以免疫炎癥損傷的調(diào)節(jié)作用。2.真武湯對(duì)阿霉素NS大鼠水腫及腎臟AQP2表達(dá)的影響制備阿霉素NS大鼠模型,造模一周后給予真武湯高(16.8g·kg-1·d-1)、低(8.4g·kg-1·d-1)治療,連續(xù)給藥四周。通過(guò)檢測(cè)各組大鼠腹水重量、腎臟指數(shù)以及血液及尿液Na+、K+、Cl-含量,考察真武湯對(duì)NS大鼠水腫及電解質(zhì)的的調(diào)節(jié)作用；并檢測(cè)血清(AVP)及醛固酮(ALD)水平,測(cè)定各組大鼠腎組織AQP2表達(dá)及分布情況,探討真武湯治療NS的可能作用機(jī)制。3.腎病綜合征大鼠腎臟miRNA差異表達(dá)譜研究分別取正常及阿霉素NS模型大鼠腎組織,提取總RNA,純化后進(jìn)行miRNA標(biāo)記、雜交。應(yīng)用GenePix Pro 6.0讀取芯片結(jié)果,對(duì)結(jié)果進(jìn)行中值標(biāo)準(zhǔn)化,篩選差異表達(dá)的miRNA;利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具,對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),GO功能富集及Pathway分析,構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),挖掘可能性高的靶基因及調(diào)節(jié)通路,探討miRNA在NS發(fā)病中的調(diào)節(jié)作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。4.篩選真武湯治療NS中可調(diào)控AQP2表達(dá)的miRNA利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)手段,結(jié)合miRNA芯片結(jié)果及qRT-PCR驗(yàn)證,以及體外過(guò)表達(dá)或抑制miRNA活性,篩選NS中可能調(diào)控AQP2表達(dá)的miRNA;并通過(guò)熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)miRNA與AQP2間的調(diào)控關(guān)系,MTT及流式檢測(cè)miRNA對(duì)集合管細(xì)胞增殖及凋亡的影響,結(jié)合真武湯含藥血清干預(yù)實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)真武湯對(duì)AQP2及miRNA的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：1.真武湯對(duì)阿霉素NS大鼠的治療作用研究(1)阿霉素注射可誘導(dǎo)典型的NS模型,造模兩周后模型組蛋白尿升高較空白對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,真武湯治療兩周后可降低阿霉素NS大鼠蛋白尿,改善高血脂及低蛋白血癥,恢復(fù)NS大鼠腎功能；腎臟病理提示各組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常,模型組大鼠腎小管及腎間質(zhì)存在明顯腫脹,存在大量的蛋白管型及透明管型,真武湯可改善腎小管水腫,改的腎小管管型。(2)真武湯具有一定的抗氧化作用作用,可減少阿霉素NS大鼠腎臟氧化損傷,增強(qiáng)腎臟抗氧化能力,同時(shí)對(duì)腎臟免疫炎癥具有一定的調(diào)節(jié)作用,可上調(diào)腎組織IL-4表達(dá),下調(diào)IL-8的表達(dá)。2.真武湯對(duì)阿霉素NS大鼠的電解質(zhì)及腎臟水腫的作用研究(1)阿霉素誘導(dǎo)的NS大鼠有明顯水腫表現(xiàn),表現(xiàn)為腹水增多,腎臟腫大,腎臟指數(shù)增加,且尿量較正常大鼠明顯減少；真武湯治療可明顯改善腎臟水腫,具有一定利尿作用,可促進(jìn)腎臟鈉排泄,而對(duì)尿液鉀離子及氯離子排泄量沒(méi)有明顯變；(2)阿霉素NS大鼠血清ALD及AVP較正常對(duì)照組明顯升高,真武湯治療可降低ALD含量,對(duì)血清AVP水平上調(diào)無(wú)明顯作用：阿霉素NS大鼠腎臟AQP2表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低,殘存的AQP2主要分布在集合管細(xì)胞頂端質(zhì)膜,提示AQP2表達(dá)抑制,而胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制并未受到影響,真武湯治療可明顯提高腎臟AQP2表達(dá),從而提高AQP2在集合管細(xì)胞頂端質(zhì)膜的分布。3.腎病綜合征大鼠腎臟miRNA差異表達(dá)譜研究與正常對(duì)照組相比,阿霉素NS大鼠腎臟miRNA表達(dá)譜分析共發(fā)現(xiàn)123個(gè)差異表達(dá)miRNAs (fold chang2.0),其中有48個(gè)miRNA明顯上調(diào),75個(gè)明顯下調(diào),提示miRAN在NS發(fā)病中有具有重要作用。與李春慶等在PAN腎病大鼠腎臟miRNA芯片結(jié)果比較及驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)有11個(gè)miRNA重合,提示這些可能是NS發(fā)病中具有代表性miRNA。對(duì)這些差異miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miRNAs對(duì)腎臟具有多重調(diào)節(jié)作用,對(duì)NS水鈉代謝紊亂的多條通路均有調(diào)節(jié)作用,對(duì)NS免疫炎癥反應(yīng)、間質(zhì)纖維化及腎臟自噬可能具有重要調(diào)節(jié)作用。4.AQP2及miRNA在腎病綜合征發(fā)病中的作用及真武湯干預(yù)研究(1)結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)手段和芯片結(jié)果,miR-92b及miR-340-3p可能是NS發(fā)病中調(diào)節(jié)AQP2表達(dá)的miRNA,真武湯可調(diào)節(jié)腎臟miR-92b的表達(dá),而對(duì)miR-340-3p作用不明顯；miR-92b過(guò)表達(dá)可明顯抑制集合管AQP2蛋白表達(dá),而抑制miR-92b的作用可上調(diào)AQP2蛋白表達(dá),過(guò)表達(dá)或抑制miR-340-3p對(duì)AQP2蛋白表達(dá)無(wú)明顯作用,提示miR-92b可調(diào)節(jié)AQP2表達(dá)。(2)熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),AQP2野生型質(zhì)粒與miR-92b模擬物可顯著降低AQP2野生型的報(bào)告熒光,而對(duì)AQP2預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)進(jìn)行突變后,與miR-92b模擬物共孵育后,突變型載體中的報(bào)告熒光無(wú)明顯下調(diào)作用,提示miR-92b可直接調(diào)節(jié)AQP2表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-92b可抑制集合管細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡,真武湯可抑制miR-92b表達(dá),減少miR-92b上調(diào)誘導(dǎo)的結(jié)合管細(xì)胞損傷,提示miR-92b對(duì)集合管細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能可能具有重要調(diào)節(jié)作用,真武湯可通過(guò)調(diào)節(jié)集合管miR-92b及AQP2表達(dá),維持集合管細(xì)胞功能穩(wěn)定。結(jié)論：1.真武湯對(duì)阿霉素NS大鼠具有一定的保護(hù)作用,對(duì)蛋白尿、高血脂、低蛋白血癥及腎功能具有一定改善作用,其作用與其調(diào)節(jié)腎臟炎癥反應(yīng),增強(qiáng)腎臟抗氧化能力可能具有一定關(guān)系：2.真武湯對(duì)阿霉素NS大鼠腹水及腎肥大具有明顯的改善作用,可改善腎小管水腫及管型蛋白,這可能與真武湯利尿、促進(jìn)腎臟尿鈉排泄有關(guān)、降低血清醛固酮水平有關(guān),提示真武湯對(duì)NS水腫具有較好治療作用,對(duì)腎小管具有一定保護(hù)作用；3.AQP2在阿霉素NS大鼠中表達(dá)下調(diào),但其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制并未受到抑制,AQP2在集合管細(xì)胞頂端質(zhì)膜分布無(wú)明顯變化,而阿霉素NS大鼠血清AVP表達(dá)較正常組升高,提示AVP可能參與了AQP2短期調(diào)節(jié),而有其他調(diào)節(jié)機(jī)制參與了AQP2的表達(dá)抑制調(diào)節(jié)；4.NS大鼠腎臟miRNAs與正常對(duì)照組大鼠存在較大差異,miRNAs對(duì)NS發(fā)病的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)均有重要調(diào)節(jié)作用；5.miR-92b在阿霉素NS大鼠腎臟表達(dá)升高,可直接調(diào)控AQP2表達(dá),可能參與了NS中AQP2抑制的調(diào)節(jié),過(guò)表達(dá)miR-92b可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,提示miR-92b可能通過(guò)其他途徑參與NS疾病的發(fā)生發(fā)展。綜上,真武湯治療阿霉素NS的機(jī)制可能包括：①減少腎臟免疫炎癥損傷,減輕腎臟氧化損傷,提高腎臟抗氧化能力；②減輕腎臟水腫,調(diào)節(jié)腎臟水鈉代謝；③調(diào)節(jié)腎臟AQP2表達(dá),維持正常腎小管結(jié)構(gòu)和腎臟水液代謝功能；④通過(guò)調(diào)節(jié)miR-92b參與腎臟功能的調(diào)節(jié)。
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【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R277.5

【參考文獻(xiàn)】

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2 李莎莎;肖雪;韓凌;黎莉;王義明;羅國(guó)安;;真武湯對(duì)腎纖維化大鼠血清和腎臟組織中SOD活力、MDA含量的影響[J];中藥藥理與臨床;2012年02期

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本文編號(hào)：1589084