目的本課題通過體內外實驗探討石斛合劑通過調控PI3K/Akt和GCGR/PKA信號通路改善肝臟胰島素抵抗,抑制糖異生的作用機制。方法1.大鼠肝組織iTRAQ蛋白組學檢測雌性Wistar大鼠40只,隨機分為正常組10只和造模組30只。正常組予普通飼料喂養(yǎng),造模組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周后腹腔注射2次STZ(25 mg/kg +m2,間隔72 h)。篩選出糖尿病成模大鼠,再隨機分為3組(模型組、石斛合劑組和二甲雙胍組)。石斛合劑組以石斛合劑1號方(17.2 g/kg·d-l)和石斛合劑2號方(12.4 g/kg·d-1)灌胃,二甲雙胍組以二甲雙胍灌胃(100mg/kg·d),模型組、正常組用生理鹽水灌胃,均持續(xù)灌胃60天。各組動物均于最后一次用藥后24小時后剖腹取肝組織。利用以iTRAQ為標記的液相色譜質譜聯(lián)用技術,對大鼠肝臟進行蛋白組學檢測,定量觀察各組大鼠肝臟的蛋白質差異表達情況,尋找組間的差異蛋白和相關信號通路,為后續(xù)研究打下基礎。2.動物實驗SPF級健康雌性Wistar大鼠50只,隨機選取11只為正常組,其余39只大鼠按上述方法造模和分組干預,持續(xù)灌胃12周后采血取材。檢測空腹血糖、...

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【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
前言
第一部分 基于iTRAQ技術的糖尿病大鼠肝組織的蛋白組學研究
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 實驗藥物
        1.3 主要試劑與儀器
        1.4 主要試劑配制
    2 研究方法
        2.1 動物模型制備
        2.2 動物分組和干預
        2.3 動物取材
        2.4 iTRAQ檢測肝組織蛋白質組學
        2.5 生物信息分析
    3 結果
        3.1. 質譜基本鑒定信息和質量評估
        3.2 COG分類圖注釋
        3.3 GO注釋
        3.4 肝臟組織差異蛋白質的篩選
        3.5 Pathway代謝通路注釋
    4 討論
        4.1 iTRAQ蛋白質組學
        4.2 GO注釋
        4.3 肝臟組織差異蛋白質
        4.4 Pathway信號通路富集分析
    5 小結
第二部分 石斛合劑改善糖尿病大鼠胰島素抵抗抑制糖異生的機制研究
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 實驗藥物
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
        1.5 主要試劑的配制
    2 研究方法
        2.1 糖尿病大鼠模型的制備
        2.2 動物分組及干預
        2.3 動物取材
        2.4 整體糖脂代謝指標測定
        2.5 ELISA法檢測各組空腹胰島素、胰高血糖素
        2.6 肝臟組織病理學觀察
        2.7 免疫組化檢測PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相關蛋白的表達
        2.8 RT-PCR法檢測PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相關基因的mRNA表達情況
        2.9 Western bolt檢測各組PI3K/Akt和GCGR/PKA通路相關蛋白表達
        2.10 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 動物一般狀況
        3.2 各組大鼠血清學指標的變化
        3.3 各組大鼠肝組織HE染色結果
        3.4 石斛合劑對糖尿病大鼠GCGR/PKA和PI3K/AKT通路相關基因表達的影響
        3.5 石斛合劑對大鼠肝組織PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相關蛋白表達的影響
    4 討論
        4.1 糖尿病大鼠模型的構建
        4.2 干預藥物石斛合劑和陽性對照藥的選擇依據(jù)
        4.3 石斛合劑對糖尿病模型大鼠糖脂代謝和肝功能的影響
        4.4 石斛合劑對糖尿病模型大鼠肝臟形態(tài)學的影響
        4.5 石斛合劑對GCGR/PKA信號通路的影響
        4.6 石斛合劑通過調控P13K/Akt信號通路影響糖異生
        4.7 石斛合劑對糖異生關鍵限速酶PEPCK和G6Pase的影響
    5 小結
第三部分 石斛合劑對胰島素抵抗肝細胞糖異生的的作用及其機制
    1 材料
        1.1 細胞
        1.2 藥物
        1.3 主要試劑和耗材
        1.4 主要儀器
        1.5 主要試劑配制
    2 研究方法
        2.1 細胞培養(yǎng)、傳代與凍存
        2.2 石斛合劑含藥血清及空白血清制備
        2.3 MTT法篩選石斛合劑含藥血清濃度
        2.4 篩選胰島素的干預濃度
        2.5 篩選建立IR肝細胞模型的造模胰島素濃度
        2.6 高胰島素誘導L02肝細胞胰島素抵抗模型的建立和鑒定
        2.7 實驗分組及干預
        2.8 各組肝細胞糖消耗量的變化
        2.9 Realtime PCR檢測各組的InsR、GluR、FoxO1、PEPCK和G6Pase的mRNA表達
        2.10 Western-blotting實驗檢測PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相關蛋白的表達
        2.11 加入PI3K抑制劑后檢測PI3K/AKT通路相關蛋白表達的影響
        2.12 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)
    3 結果
        3.1 MTT法確定石斛合劑含藥血清濃度
        3.2 有效胰島素干預濃度的篩選
        3.3 建立IR肝細胞模型的胰島素濃度篩選
        3.4 L02細胞IR模型的鑒定
        3.5石斛合劑含藥血清對IR肝細胞糖消耗量的影響
        3.6 石斛合劑對各組肝細胞InsR、FoxO1、PEPCK、G6Pase和GCGR的mRNA表達的影響
        3.7 石斛合劑對各組肝細胞PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相關蛋白表達的影響
        3.8 加入PI3K抑制劑后石斛合劑對IR肝細胞PI3K/AKT通路相關蛋白表達的影響
    4 討論
        4.1 肝胰島素抵抗對糖尿病的影響
        4.2 IR細胞模型構建
        4.3 石斛合劑治療糖尿病的中藥活性成分以及中藥含藥血清法的應用
        4.4 石斛合劑對IR肝細胞的糖消耗試驗的影響
        4.5 石斛合劑通過P13K/Akt信號通路對糖異生的影響
        4.6 石斛合劑通過GCGR/PKA信號通路對糖異生的影響
        4.7 加入PI3K抑制劑后石斛合劑通過P13K/Akt信號通路對糖異生的影響
    5 小結
結論
參考文獻
文獻綜述1 胰高血糖素信號通路與糖尿病肝糖異生的研宄進展
    參考文獻
文獻綜述2 中藥活性成分防治糖尿病的研究進展
    參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3982435