發(fā)布時間：2024-05-19 18:09

　　實驗一雷公藤甲素誘導(dǎo)離體原代培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬的研究目的:觀察雷公藤甲素(triptolide,TP)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞(granulosa cells,GCs)自噬所需的濃度、時間和作用機制。方法:1.采用CCK-8法比較不同濃度的TP對原代培養(yǎng)大鼠卵巢GCs的抑制作用并計算IC50;WB法檢測不同濃度、時間點下TP對GCs自噬相關(guān)因子蛋白表達(dá)及PI3K/AKT/mTOR通路級聯(lián)的影響。2.WB法檢測TP、自噬誘導(dǎo)劑(BrefeldinA)、PI3K/mTOR抑制劑(NVP-BEZ235)分別干預(yù)GCs對PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.不同濃度TP作用于大鼠卵巢GCs的IC50為14.65μM,其中最小抑制濃度為0.1μM(100nM)。2.與空白對照組相比,各組Beclin1、LC3II蛋白表達(dá)水平均升高,LC3I及p62蛋白表達(dá)水平均下降,其中TP(100nM)作用與大鼠GCs12h,各指標(biāo)變化顯著(p<0.05或p<0.01);3.TP,BrefeldinA,NVP-BEZ235分別處理大鼠GCs12h后,與空白對照組相比,TP...

【文章頁數(shù)】：139 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
引言
第一部分 理論研究
    一 卵泡發(fā)育障礙類疾病的研究現(xiàn)況
    二 顆粒細(xì)胞自噬對卵泡發(fā)育和閉鎖的調(diào)控
    三 顆粒細(xì)胞自噬與PI3K/AKT/mTOR信號通路
    四 導(dǎo)師治療卵泡發(fā)育障礙類疾病臨證經(jīng)驗
第二部分 實驗研究
    課題的前期研究基礎(chǔ)及創(chuàng)新性
        研究基礎(chǔ)
        研究創(chuàng)新點
    實驗一 雷公藤甲素誘導(dǎo)離體原代培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬的研究
        1 材料與試劑
            1.1 實驗動物和實驗條件
            1.2 主要藥物、試劑和儀器
            1.3 實驗分組
        2 實驗方法
            2.1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)
            2.2 離體培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞鑒定
            2.3 CCK8法檢測TP對GCs增殖的抑制
            2.4 WB法檢測各組卵巢GCs中Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、p-PI3K，p-AKT及p-mTOR蛋白表達(dá)
        3 統(tǒng)計分析
        4 實驗結(jié)果
            4.1 體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
            4.2 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定
            4.3 雷公藤甲素對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增值的抑制作用
            4.4 雷公藤甲素誘導(dǎo)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬濃度的確定
            4.5 雷公藤甲素誘導(dǎo)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬時間的確定
            4.6 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑確定及機制研究
        5 討論
            5.1 選擇顆粒細(xì)胞(GCs)作為研究對象的原因
            5.2 采用雷公藤甲素誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞自噬的原因
            5.3 實驗指標(biāo)的意義與結(jié)果分析
        6 結(jié)論
    實驗二 基于PI3K/AKT/mTOR信號通路研究補腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸對雷公藤甲素致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬的調(diào)控
        1 材料與試劑
            1.1 實驗動物和實驗條件
            1.2 主要藥物
            1.3 主要試劑和儀器
        2 實驗方法
            2.1 實驗技術(shù)路線圖
            2.2 大鼠含藥血清的制備
            2.3 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的TP誘導(dǎo)處理
            2.4 實驗分組及添加受試藥物處理
            2.5 Elisa法檢測顆粒細(xì)胞分泌E₂、P含量
            2.6 透射電子顯微鏡下觀察各組自噬小體數(shù)量
            2.7 RT-qPCR法檢測大鼠卵巢顆粒細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR及自噬相關(guān)因子的mRNA相對表達(dá)量
            2.8 WB法檢測顆粒細(xì)胞中的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR及自噬相關(guān)因子蛋白表達(dá)
            2.9 免疫熒光觀察各組顆粒細(xì)胞中信號通路及自噬相關(guān)因子的表達(dá)
        3 統(tǒng)計分析
        4 實驗結(jié)果
            4.1 藥效實驗
            4.2 機制實驗
        5 討論
            5.1 補腎活血法治療卵泡發(fā)育障礙類疾病的立法依據(jù)
            5.2 補腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸的方藥分析
            5.3 陽性對照藥物的選擇
            5.4 補腎中藥復(fù)方調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促卵泡發(fā)育的實驗研究現(xiàn)況
            5.5 調(diào)控細(xì)胞自噬是中藥發(fā)揮藥理作用的重要機制
            5.6 實驗指標(biāo)意義與結(jié)果分析
        6 結(jié)論
問題與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附件
    綜述一 自噬與中醫(yī)藥延緩卵巢衰老的研究進展
        參考文獻(xiàn)
    綜述二 基于“腎主生殖”理論認(rèn)識細(xì)胞自噬與卵泡發(fā)育
        參考文獻(xiàn)
    在讀期間公開發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
    在讀期間參加的學(xué)術(shù)會議



本文編號：3978266