發(fā)布時間：2024-04-23 04:30

　　目的體外實驗研究羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor Yellow A,HSYA)對氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧(Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)的保護作用及其可能的自噬調(diào)節(jié)機制。方法1.OGD/R后大鼠BMECs損傷與自噬調(diào)節(jié)的關(guān)系(1)原代培養(yǎng)新生大鼠的BMECs,采用常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合VIII因子免疫熒光鑒定對大鼠BMECs進行鑒定;(2)采用常規(guī)培養(yǎng)箱結(jié)合缺氧小室(5%CO2和95%N2)和無糖DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)的方法建立OGD/R損傷BMECs模型,設(shè)置OGD/R不同時間點(0h、3h、9h、12h、24h、48h、72h);(3)MTT法和LDH法分別檢測OGD/R損傷后細胞增殖活性、細胞膜通透性的變化;(4)透射電子顯微鏡觀察OGD/R損傷后細胞的超微結(jié)構(gòu)變化;(5)Western-Blotting法檢測OGD/R損傷后自...

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表（Abbreviation）
前言
第一部分 OGD/R后大鼠BMECs損傷與自噬調(diào)節(jié)的關(guān)系
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 實驗動物
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
        2.4 主要溶液配制
    3 實驗方法
        3.1 BMECs的原代培養(yǎng)及鑒別
            3.1.1 BMECs的原代培養(yǎng)
            3.1.2 BMECs的鑒別
        3.2 OGD/R損傷BMECs模型的建立
        3.3 實驗分組
        3.4 細胞存活率檢測（MTT法）
        3.5 乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測
        3.6 透射電鏡觀察自噬體超微結(jié)構(gòu)
        3.7 Western-Blotting法檢測蛋白表達
            3.7.1 蛋白提取
            3.7.2 Western-Blotting法檢測自噬標志蛋白LC3、Beclin-1 表達
    4 統(tǒng)計學(xué)分析
    5 實驗結(jié)果
        5.1 BMECs的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定
        5.2 OGD/R不同時間點對BMECs增殖活力的影響
        5.3 OGD/R不同時間點對BMECs內(nèi)LDH活性的影響
        5.4 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)
        5.5 OGD/R損傷BMECs不同時程自噬的變化
    6 討論
    7 結(jié)論
第二部分 HSYA調(diào)節(jié)自噬保護OGD/R損傷大鼠BMECs
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 實驗動物
        2.2 藥物
        2.3 主要試劑
        2.4 主要儀器
        2.5 主要溶液配制
    3 實驗方法
        3.1 BMECs的原代培養(yǎng)及鑒別
        3.2 OGD/R損傷BMECs模型的建立
        3.3 HSYA安全濃度范圍篩選（MTT法）
            （1）MTT法檢測HSYA對正常BMECs的濃度篩選
            （2）MTT法檢測HSYA對OGD/R損傷BMECs的濃度篩選
        3.4 實驗分組
        3.5 倒置顯微鏡觀察BMECs形態(tài)學(xué)變化
        3.6 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)
        3.7 細胞存活率檢測（Alamar Blue法）
        3.8 LDH活性檢測
        3.9 Hochest33258染色檢測細胞凋亡
        3.10 TEER值的測定
        3.11 細胞免疫熒光檢測LC3蛋白表達
        3.12 RT-PCR檢測LC3基因表達
        3.13 Western-Blotting法檢測ZO-1、Beclin-1、LC3蛋白的表達
    4 統(tǒng)計學(xué)分析
    5 結(jié)果
        5.1 HSYA安全濃度范圍篩選
            （1）HSYA對正常培養(yǎng)狀態(tài)下BMECs活性的影響
            （2）MTT法檢測HSYA對OGD/R時BMECs活性的影響
        5.2 BMECs形態(tài)學(xué)觀察
        5.3 HSYA對OGD/R損傷BMECs超微結(jié)構(gòu)的影響
        5.4 HSYA對OGD/R損傷BMECs增殖活力的影響
        5.5 HSYA對OGD/R損傷BMECs內(nèi)LDH活性的影響
        5.6 Hochest33258染色檢測細胞凋亡形態(tài)
        5.7 TEER值的測定
        5.8 HSYA對OGD/R損傷BMECs上TJ蛋白表達的影響
        5.9 細胞免疫熒光檢測LC3蛋白表達
        5.10 RT-PCR檢測LC3基因表達
        5.11 HSYA對OGD/R損傷BMECs自噬標志蛋白表達的影響
    6 討論
    7 結(jié)論
第三部分 HSYA保護OGD/R損傷大鼠BMECs的自噬調(diào)節(jié)途徑研究
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 實驗動物
        2.2 藥物
        2.3 主要試劑
        2.4 主要儀器
        2.5 主要溶液配制
    3 實驗方法
        3.1 BMECs的原代培養(yǎng)及鑒別
        3.2 OGD/R損傷BMECs模型的建立
        3.3 實驗分組
        3.4 細胞存活率檢測（MTT法）
        3.5 LDH活性檢測
        3.6 Western-Blotting法檢測蛋白的表達
    4 統(tǒng)計學(xué)分析
    5 實驗結(jié)果
        5.1 HSYA與ZSTK474合用對OGD/R損傷BMECs的保護作用52
        5.2 HSYA與ZSTK474合用對OGD/R損傷BMECs自噬標志蛋白表達的影響
        5.3 HSYA與ZSTK474合用對PI3K/Akt/mTOR通路上主要蛋白表達的影響
    6 討論
    7 結(jié)論
    8 展望
參考文獻
技術(shù)路線圖
綜述 自噬與腦缺血再灌注損傷
    參考文獻
個人簡歷
致謝



本文編號：3962619