目的基于肝纖維化時(shí)血管新生的病理機(jī)制,以肝纖維化不同時(shí)期的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)與VEGF過表達(dá)的肝星狀細(xì)胞(HSC)共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)材料,探討疏肝健脾方含藥血清對(duì)VEGF調(diào)控的抗肝纖維化機(jī)制,并確定該方的最佳干預(yù)時(shí)相。方法1.分離正常大鼠HSC及SEC,大鼠皮下注射CCl4制備肝纖維化模型,分別于造模的第2w、4w、8w分離模型大鼠SEC;2.針對(duì)大鼠VEGF基因構(gòu)建sh RNA重組慢病毒,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HSC,共聚焦顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HSC綠色熒光蛋白表達(dá)、免疫印跡蛋白(Western Blot)檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá);3.中濃度疏肝健脾活血方行大鼠灌胃制備含藥血清,得到含藥血清后配置為不同濃度的含藥血清培養(yǎng)基作用于HSC,MTT法檢測(cè)不同濃度的疏肝健脾活血方含藥血清對(duì)HSC增殖的影響,確定含藥血清最佳有效濃度;4.分別取2w、4w、8w三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分離得到的正常大鼠HSC和SEC、肝纖維化模型大鼠SEC、轉(zhuǎn)染得到的VEGF過表達(dá)HSC分為如下6組:H組:正常大鼠HSC完全培養(yǎng)基培養(yǎng);HS組:正常大鼠HSC和正常大鼠SEC完全培養(yǎng)基共培養(yǎng);HM組:正常大鼠HSC和模型大鼠SEC完全培養(yǎng)基共培...

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 大鼠HSC及SEC原代分離實(shí)驗(yàn)研究
    一、材料與方法
        (一)實(shí)驗(yàn)材料
            1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            2.主要實(shí)驗(yàn)試劑
            3.主要儀器設(shè)備
            4.主要試劑配制
        (二)實(shí)驗(yàn)方法
            1.模型制備
            2.HSC及SEC分離
            3.臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)及免疫熒光鑒定
    二、結(jié)果
        (一)光鏡下觀察結(jié)果
        (二)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)結(jié)果
        (三)免疫熒光鑒定結(jié)果
第二部分 shRNA重組慢病毒感染大鼠HSC過表達(dá)VEGF實(shí)驗(yàn)研究
    一、材料與方法
        (一)實(shí)驗(yàn)材料
            1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
            2.主要實(shí)驗(yàn)試劑
            3.主要儀器設(shè)備
        (二)實(shí)驗(yàn)方法
            1.慢病毒載體的構(gòu)建
            2.病毒包裝
            3.病毒感染HSC
            4.嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞
            5.指標(biāo)檢測(cè)
            6.統(tǒng)計(jì)方法
    二、結(jié)果
        (一)慢病毒PCR測(cè)序結(jié)果
        (二)熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后HSC細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)變化
        (三)轉(zhuǎn)染后VEGF相對(duì)表達(dá)量
第三部分 VEGF/VEGFR在HSC/SEC共培養(yǎng)體系中的表達(dá)及疏肝健脾活血方的干預(yù)作用
    一、材料與方法
        (一)實(shí)驗(yàn)材料
            1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
            2.實(shí)驗(yàn)藥材
            3.主要實(shí)驗(yàn)試劑
            4.主要儀器設(shè)備
            5.PCR引物和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下
        (二)實(shí)驗(yàn)方法
            1.含藥血清制備
            2.MTT法確定最佳含藥血清濃度
            3.細(xì)胞分組及干預(yù)
            4.指標(biāo)檢測(cè)
            5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    二、結(jié)果
        (一)最佳含藥血清的濃度確定
        (二)各組HSC活力及增值率
        (三)各組SEC中CD31、vWF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較
        (四)各組中HSC的膠原Ⅳ、VEGF、VEGFR-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較
        (五)各組中HSC的VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果
    三、分析與討論
        (一)VEGF在血管新生中起重要作用
        (二)VEGF在肝纖維化發(fā)展中促進(jìn)病理性血管新生
            1.SEC與肝竇毛細(xì)血管化
            2.VEGF加重肝竇毛細(xì)血管化促進(jìn)肝纖維化發(fā)展
            3.VEGF促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)形成加重血液分流
            4.VEGF增加血管通透性并加重炎癥反應(yīng)
        (三)中醫(yī)學(xué)對(duì)肝纖維化中病理性血管新生的認(rèn)識(shí)
            1.病名的認(rèn)識(shí)
            2.病因病機(jī)
            3.中醫(yī)治則治法
            4.疏肝健脾活血方的組方及功效
        (四)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
            1.SEC失窗孔后加重肝纖維化
            2.VEGF在肝纖維早期即促進(jìn)肝竇毛細(xì)血管化的發(fā)展
            3.疏肝健脾活血方對(duì)肝纖維化時(shí)病理性血管新生干預(yù)的作用機(jī)制
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附圖
致謝
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3759759