本文關(guān)鍵詞：基于紅細(xì)胞溶血貧血探討地中海貧血患者證候季節(jié)變化的分子機(jī)制

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【摘要】：背景：地中海貧血(簡(jiǎn)稱(chēng)地貧)是由于珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致珠蛋白合成障礙的一組遺傳性溶血性貧血,其中最常見(jiàn)的是α-地貧和β-地貧。地貧至今仍無(wú)有效的治療辦法。導(dǎo)師吳志奎教授課題組,根據(jù)中醫(yī)“腎藏精生髓、髓生血”經(jīng)典理論,從腎論治治療地貧,經(jīng)過(guò)三十多年的臨床實(shí)踐,首次對(duì)中醫(yī)藥治療地貧從理論基礎(chǔ)、核心病機(jī)、治則治法、作用特點(diǎn)和可能機(jī)制等提出了較明確的理論認(rèn)識(shí),形成了系統(tǒng)的理論與有效治法,取得了領(lǐng)先的臨床研究成果。通過(guò)系列的臨床和實(shí)驗(yàn)研究,驗(yàn)證了“腎生髓、髓生血”理論指導(dǎo)地貧臨床治療的有效性和科學(xué)性。本課題組2006年對(duì)112例中間型地貧患者進(jìn)行中醫(yī)證候調(diào)查,發(fā)現(xiàn)地貧患者中醫(yī)證候多為肝腎陰虛,精血不足證,病情嚴(yán)重程度與季節(jié)變化有關(guān),即夏季溶血貧血嚴(yán)重,冬季有所緩解,其證候變化的特點(diǎn)是基本證型未變,但臨床癥狀有明顯的季節(jié)改變,這種證候季節(jié)變化,體現(xiàn)了中醫(yī)“天人合一,四時(shí)陰陽(yáng)”的整體觀,這種證候季節(jié)變化可能與血液參數(shù)季節(jié)性改變有關(guān)。既往有關(guān)地貧患者證候季節(jié)變化的臨床報(bào)道鮮有,尚未見(jiàn)地貧患者證候季節(jié)變化生物學(xué)機(jī)制研究的報(bào)道。本課題是依托國(guó)家自然科學(xué)基金和“973”研究課題,在前期發(fā)現(xiàn)和探索的基礎(chǔ)上,探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床證候的影響；從紅細(xì)胞溶血貧血的角度探討地貧患者證候季節(jié)變化的可能物質(zhì)基礎(chǔ)；并進(jìn)一步從紅細(xì)胞溶血貧血的角度探討益髓生血顆粒治療地貧的療效可能機(jī)制。目的：以地貧患者為研究對(duì)象,從血液指標(biāo)和中醫(yī)證候量化評(píng)分兩個(gè)方面探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床表現(xiàn)的影響；從紅細(xì)胞溶血貧血這一角度闡釋地貧患者證候季節(jié)變化的可能分子機(jī)制,探討證候季節(jié)變化與紅細(xì)胞溶血貧血的內(nèi)在關(guān)系,為中醫(yī)“四時(shí)”理論指導(dǎo)地貧臨床治療提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1地貧患者證候季節(jié)變化的臨床觀察 以高發(fā)區(qū)地貧患者為研究對(duì)象,進(jìn)行了兩批次的臨床觀察。第一批次臨床觀察：在冬夏兩季分別選取一組HbH病患者,冬季組HbH病患者35例,夏季組HbH病患者31例,比較兩組HbH病患者血液指標(biāo)和中醫(yī)證候量化評(píng)分水平的差異,初步探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床證候的影響。第二批次臨床觀察：選取11例地貧患者(5例α-地貧、6例β-地貧),對(duì)11例地貧患者進(jìn)行冬夏兩季的連續(xù)觀察,動(dòng)態(tài)檢測(cè)地貧患者冬夏兩季血液指標(biāo)水平并對(duì)中醫(yī)證候進(jìn)行量化評(píng)分,進(jìn)一步探討季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床證候的影響。2基于紅細(xì)胞溶血貧血探討地貧患者證候季節(jié)變化分子機(jī)制在臨床研究的基礎(chǔ)上,針對(duì)地貧患者紅細(xì)胞溶血和貧血的臨床特點(diǎn),采用RT-PCR、ELISA、透射電鏡、比色法、比濁法、WB法等分子生物學(xué)技術(shù),研究冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞溶血和貧血相關(guān)指標(biāo)(血清鐵和血清鐵蛋白、紅細(xì)胞抗氧化損傷、紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA表達(dá)、紅細(xì)胞包涵體含量、紅細(xì)胞膜相關(guān)離子通透酶、造血細(xì)胞因子)等水平的差異,從紅細(xì)胞溶血和貧血角度探討地貧患者證候季節(jié)變化的可能分子機(jī)制。3基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧的療效可能機(jī)制選取16例地貧患者,從地貧患者紅細(xì)胞溶血和貧血的角度探討治療前后珠蛋白鏈比、紅細(xì)胞抗氧化損傷水平、紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA表達(dá)、紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性、造血細(xì)胞因子活性、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白表達(dá)、BCL11AmRNA的表達(dá)等指標(biāo)水平的變化,探討益髓生血顆粒治療地貧的療效可能的分子機(jī)制。結(jié)果：1證候季節(jié)變化的臨床觀察1)季節(jié)變化對(duì)HbH病患者證候影響的臨床觀察冬季組HbH病患者主要血液指標(biāo)Hb水平顯著高于夏季組HbH病患者(P0.05),冬季組HbH病患者Ret、HbH水平顯著低于夏季組(P0.05)。冬夏兩組HbH病患者RBC水平無(wú)明顯差異。夏季組缺失型HbH病患者Hb水平顯著低于冬季組(P0.05)；冬夏兩組非缺失型HbH病患者Hb水平比較無(wú)明顯差異。冬季組HbH病患者面色萎黃、爪甲色淡、耳鳴、口咽干燥的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯著低于夏季組(P0.01或P0.05)；腰膝酸軟、潮熱盜汗中醫(yī)證候量化評(píng)分冬夏兩組無(wú)明顯差異。冬季組非缺失型HbH病患者面色萎黃、耳鳴、口咽干燥的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯著低于夏季組(P0.05或P0.01)。冬季組缺失型HbH病患者面色萎黃、爪甲色淡、腰膝酸軟、口咽干燥的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯著低于夏季組(P0.05或P0.01)。冬季組HbH病患者中無(wú)論是非缺失型還是缺失型,其大多中醫(yī)證候量化評(píng)分均低于夏季組,提示夏季病情較重,冬季有緩解。初步說(shuō)明了地貧患者臨床癥狀受季節(jié)變化的影響。2)季節(jié)變化對(duì)同一組地貧患者證候影響的連續(xù)觀察11例地貧患者冬季主要血液指標(biāo)Hb水平顯著高于夏季(P0.05),冬夏兩季RBC、Ret水平無(wú)明顯差異。11例地貧患者冬季爪甲色淡、食少納呆、潮熱盜汗的中醫(yī)證候量化評(píng)分顯著低于夏季(P0.05)；頭暈?zāi)垦！⒕氲》α�、腰膝酸軟中醫(yī)證候量化評(píng)分冬夏兩季無(wú)明顯差異。同一組地貧患者冬夏兩季的連續(xù)觀察結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了地貧患者溶血貧血嚴(yán)重程度受季節(jié)變化的影響。2基于紅細(xì)胞溶血貧血探討地貧患者證候季節(jié)變化分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究1)冬夏兩季地貧患者SI、SF水平的檢測(cè)顯示：夏季組HbH病患者SI、SF水平顯著高于冬季組(P0.05)。11例地貧患者冬季SI、SF水平與夏季水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但有低于夏季水平的趨勢(shì)。2)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞抗氧化損傷水平檢測(cè)顯示：冬季組HbH病患者抗氧化損傷指標(biāo)SOD活性顯著低于夏季組(P0.05),冬夏兩組HbH病患者M(jìn)DA含量和GSH-Px活性無(wú)明顯差異。11例地貧患者冬季SOD、GSH-Px活性顯著低于夏季(P0.01),MDA的含量顯著也低于夏季(P0.01)。3)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞包涵體含量檢測(cè)顯示：地貧患者夏季紅細(xì)胞包涵體的含量和比例明顯多于冬季。4)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA表達(dá)水平檢測(cè)顯示：冬季組HbH病患者SPTA1、SPTB、EPB4.1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于夏季組(P0.01)。11例地貧患者冬季SPTA1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于夏季(P0.05),SPTB、EPB4.1的mRNA表達(dá)水平冬夏兩季無(wú)明顯差異。5)冬夏兩季地貧患者造血細(xì)胞因子活性水平的檢測(cè)顯示：冬季組HbH病患者子SCF活性顯著高于夏季組(P0.05)。冬夏兩組HbH病患者IL-3活性水平無(wú)明顯差異。11例地貧患者冬季SCF.EPO活性水平顯著高于夏季(P0.05或P0.01),IL-3活性水平顯著低于夏季(P0.05)。6)冬夏兩季地貧患者紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性檢測(cè)顯示：冬季組HbH病患者Na+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性顯著高于夏季組(P0.05),冬夏兩組HbH病患者Ca2+-Mg2+-ATP酶活性無(wú)明顯差異。11例地貧患者冬季Nda+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性顯著高于夏季(P0.01或P0.05),Ca2+-Mg2+-ATP酶活性冬夏兩季無(wú)明顯差異。臨床實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：季節(jié)變化對(duì)地貧患者紅細(xì)胞溶血貧血相關(guān)指標(biāo)水平的影響,可能是地貧患者存在證候季節(jié)變化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。3基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧的療效可能機(jī)制3.1益髓生血顆粒治療16例地貧患者(8例α-地貧、8例β-地貧)的臨床觀察1)經(jīng)益髓生血顆粒治療3個(gè)月后,8例α-地貧患者療后2、3月Hb水平與療前相比顯著升高(P0.05)；療后2個(gè)月RBC水平顯著升高(P0.05)。8例β-地貧患者療后1至3個(gè)月,Hb水平有升高的趨勢(shì),HbF水平顯著升高(P0.01或P0.05)；療后2個(gè)月Ret水平顯著升高(P0.05)；RBC水平無(wú)明顯差異。2)經(jīng)益髓生血顆粒治療3個(gè)月后,16例地貧患者面色萎黃、潮熱盜汗、眩暈、心悸、咽干的中醫(yī)證候量化評(píng)分與療前相比顯著降低(P0.01或P0.05)；腰膝酸軟的中醫(yī)癥候量化評(píng)分與療前相比有降低的趨勢(shì)。3.2益髓生血顆粒治療地貧患者療效分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究1)治療前后珠蛋白鏈比結(jié)果顯示：8例a-地貧患者α-珠蛋白相對(duì)β-珠蛋白表達(dá)水平與療前相比顯著升高(P0.01)；Aγ-、Gγ-珠蛋白表達(dá)水平相對(duì)β-珠蛋白的表達(dá)與療前相比無(wú)顯著差異。8例8-地貧患者A Y-珠蛋白相對(duì)α-珠蛋白的表達(dá)水平與療前相比有升高的趨勢(shì),β-、Gγ-珠蛋白相對(duì)于α-珠蛋白的表達(dá)與療前相比無(wú)明顯差異。2)治療前后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)結(jié)果顯示：8例α-地貧患者]DNMT1、 DNMT3a、DNMT3b的]mRNA表達(dá)與療前相比顯著降低(P0.01)；DNMT3a、 DNMT1的蛋白表達(dá)水平與療前相比顯著降低(P0.01),DNMT3b的蛋白表達(dá)與療前相比有降低的趨勢(shì)。3)治療前后BCL11A表達(dá)水平研究結(jié)果顯示：8例β-地貧患者BCL11A基因表達(dá)與療前相比顯著降低(P0.05)。4)治療前后紅細(xì)胞抗氧化損傷水平結(jié)果顯示：16例地貧患者GSH-Px、SOD活性與療前相比顯著升高(P0.01),MDA含量與療前相比顯著降低(P0.01)。5)治療前后紅細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示：16例地貧患者SPTA1、 SPTB的mRNA表達(dá)水平與療前相比顯著升高(P0.05或P0.01)；EPB4.1mRNA的表達(dá)水平與療前相比無(wú)明顯差異。6)治療前后紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性結(jié)果顯示：與療前相比,地貧患者Na+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性顯著升高(P0.05); Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性與療前相比無(wú)明顯差異。7)治療前后造血細(xì)胞因子活性結(jié)果顯示：地貧患者SCF、GM-CSF的活性與療前相比顯著升高(P0.01),IL-3的活性與療前相比顯著降低(P0.01)。從臨床療效觀察和紅細(xì)胞溶血貧血相關(guān)指標(biāo)測(cè)定,提示益髓生血顆粒治療地貧可能與促進(jìn)紅細(xì)胞生成,延長(zhǎng)紅細(xì)胞壽命,減少紅細(xì)胞溶血等方面發(fā)揮療效作用有關(guān)。結(jié)論：1地貧患者證候季節(jié)變化的臨床觀察通過(guò)組間比較和同一組地貧患者的連續(xù)觀察提示：地貧患者溶血貧血的臨床癥狀存在季節(jié)變化的客觀性,臨床癥狀的嚴(yán)重程度與主要血液指標(biāo)Hb水平的變化相一致,即氣溫高的季節(jié)比氣溫低的季節(jié)溶血貧血嚴(yán)重。2地貧患者證候季節(jié)變化與溶血貧血相關(guān)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)研究1)SI、SF水平檢測(cè)結(jié)果提示：地貧患者夏季SI、SF水平高于冬季。提示地貧患者夏季溶血貧血重于冬季可能與夏季鐵超載較重有關(guān)。2)氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果提示：地貧患者冬季SOD、GSH-Px舌性低于夏季.MDA的含量冬季顯著低于夏季。夏季MDA含量高十冬季,加重了紅細(xì)胞氧化損傷,激發(fā)了體內(nèi)代償機(jī)制使SOD、GSH-Px活性代償性升高,從一個(gè)側(cè)面提示地貧患者夏季溶血貧血較重。3)紅絀胞包涵體含量檢測(cè)結(jié)果提示：地貧患者夏季紅細(xì)胞包涵體含量高于冬季。包涵體沉積在紅絀胞膜上,受氧化和機(jī)械損傷作用導(dǎo)致溶血,這可能是地貧患者夏季溶血貧血較重的原因之一。4)紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果提示：地貧患者證候季節(jié)變化與紅細(xì)胞膜骨架蛋白mRNA的表達(dá)水平的差異有關(guān)。5)造血細(xì)胞因子活性檢測(cè)結(jié)果提示：地貧患者夏季貧血重于冬季可能與冬夏兩季造血細(xì)胞因子活性差異有關(guān)。6)紅細(xì)胞膜相關(guān)酶活性檢測(cè)結(jié)果提示：地貧患者夏季溶血重于冬季可能原因之一與冬夏兩季紅細(xì)胞膜離子通透酶活性差異有關(guān)。3基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧臨床療效的分子機(jī)制3.1治療前后16例地貧患者(8例α-地貧和8例β-地貧)的臨床觀察益髓生血顆粒能有效改善地貧患者的臨床癥狀,改善地貧患者主要血液指標(biāo)Hb水平,患者臨床癥狀改善程度與Hb相一致。進(jìn)一步驗(yàn)證了益髓生血顆粒治療地貧的肯定療效。3.2基于紅細(xì)胞溶血貧血探討益髓生血顆粒治療地貧患者的療效實(shí)驗(yàn)研究1)珠蛋白鏈比檢測(cè)結(jié)果提示：益髓生血顆粒可能通過(guò)促進(jìn)地貧患者珠蛋白鏈比的平衡改善地貧患者紅細(xì)胞溶血貧血。2)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果提示：益髓生血顆�？赡芡ㄟ^(guò)抑制DNMTs的活性,降低DNA甲基化對(duì)α-珠蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用,提高α-肽鏈的合成,促進(jìn)珠蛋白鏈比平衡,改善紅細(xì)胞溶血貧血。3)BCL11AmRNA水平檢測(cè)結(jié)果提示：益髓生血顆粒可能通過(guò)下調(diào)BCL11A mRNA的表達(dá),促進(jìn)Aγ-珠蛋白mRNA表達(dá),進(jìn)而提高機(jī)體HbF含量,來(lái)緩解患者的貧血癥狀。與療后主要血液指標(biāo)HbF水平升高相一致。4)氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示：益髓生血顆�？赡芡ㄟ^(guò)提高紅細(xì)胞抗氧化損傷酶活性,抑制自由基對(duì)紅細(xì)胞膜的過(guò)氧化損傷作用,維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整,延長(zhǎng)紅細(xì)胞的壽命,減輕紅細(xì)胞溶血貧血。5)紅細(xì)胞膜骨架蛋白檢測(cè)結(jié)果提示：益髓生血顆粒能上調(diào)紅細(xì)胞膜骨架蛋白收縮蛋白的表達(dá),維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,減輕紅細(xì)胞溶血貧血。6)紅細(xì)胞酶活性檢測(cè)結(jié)果提示：益髓生血顆粒治療地貧的機(jī)制之一可能是通過(guò)減輕過(guò)氧化物質(zhì)對(duì)紅細(xì)胞膜的損傷作用來(lái)提高紅細(xì)胞膜酶活性,進(jìn)而更好的維持紅細(xì)胞膜變形性、完整性,減輕紅細(xì)胞溶血貧血。7)造血細(xì)胞因子活性檢測(cè)結(jié)果提示：益髓生血顆粒可能通過(guò)提高SCF、GM-CSF的活性,促進(jìn)紅系祖細(xì)胞和多種造血細(xì)胞的增殖和分化,提高有效紅細(xì)胞生成來(lái)緩解地貧患者的臨床癥狀。主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：1以中醫(yī)“四時(shí)”理論對(duì)疾病的影響為切入點(diǎn),首次探索季節(jié)變化對(duì)地貧患者臨床表現(xiàn)的影響,發(fā)現(xiàn)地貧患者夏季Hb水平低于冬季,夏季大多中醫(yī)證候量化評(píng)分水平高于冬季。提示,地貧患者夏季溶血貧血較重,冬季有所緩解,病情嚴(yán)重程度受季節(jié)變化的影響,并探討了這種變化的可能分子機(jī)制。研究結(jié)果為豐富中醫(yī)“四時(shí)”理論并為地貧臨床“適時(shí)治療”提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有重要的理論和實(shí)際意義。2本研究從季節(jié)變化對(duì)紅細(xì)胞溶血貧血相關(guān)指標(biāo)影響的角度,探討了地貧患者證候季節(jié)變化的分子機(jī)制：從地貧患者冬夏兩季血清鐵和鐵蛋白、紅細(xì)胞抗氧化損傷、紅細(xì)胞膜骨架蛋白、紅細(xì)胞包涵體含量、紅細(xì)胞膜離子通透酶活性、造血細(xì)胞因子活性等指標(biāo)水平的變化,探討了地貧患者夏季溶血貧血重于冬季的可能分子機(jī)制,在地貧臨床研究領(lǐng)域未見(jiàn)同類(lèi)報(bào)道。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R556

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1219169