背景:急性腎損傷（Acute kidney injury,AKI）是臨床常見的危重癥。缺血再灌注損傷（Ischemia reperfusion injury,IRI）是導(dǎo)致AKI的常見原因,其中腎小管上皮細(xì)胞（Tubular epithelial cells,TECs）凋亡在IRI誘導(dǎo)的AKI發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。嚴(yán)重或者持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡。黃芩苷是一種從中藥中提取的具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等藥理作用的黃酮類化合物,而且對多種器官的IRI有保護(hù)作用。但黃芩苷在保護(hù)IRI誘導(dǎo)的腎臟損害機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目的:建立低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞模型模擬IRI,探討黃芩苷是否能減輕腎小管上皮細(xì)胞（Human kidney 2 cell line,HK2細(xì)胞）凋亡及其作用機(jī)制。方法:采用HK2細(xì)胞構(gòu)建IR模型,Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP、PERK、ATF4、CHOP、Caspase12、ATF6、IRE1和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3的表達(dá),免疫熒光檢測BIP的熒光強(qiáng)度,CCK8檢測細(xì)胞死亡率,流式細(xì)胞計數(shù)和TUNEL檢測細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步采用... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：39 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)通路

圖 2. 黃芩苷減輕低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的 HK2 細(xì)胞死亡率和凋亡Figure 2. Baicalin attenuated H/R-induced cell death and cell apoptosis in HK-2 cells（A）CCK8 檢測細(xì)胞死亡率。 , p<0.05 vs. 常氧組；#, p<0.05 vs. 黃芩苷；Δ, p<0.05 vs,低 氧 / 復(fù) 氧 組 ； &, p<0.05 vs. 低 氧 / 復(fù) 氧 +25μmol/L 黃 芩 苷 組 ; (B,C) Western blot 檢 測Cleaved-caspase3 蛋白表達(dá);（D-F）流失細(xì)胞儀（D,E）和 TUNEL（F,200×）檢測細(xì)胞凋亡。n=3. , p<0.05 vs. 對照組; #, p<0.05 vs. 黃芩苷組; Δ, p<0.05 vs. 低氧/復(fù)氧組。對照組：細(xì)胞在常氧孵箱培養(yǎng)；黃芩苷組：細(xì)胞在常氧孵箱培養(yǎng)，100μmol/L 黃芩苷預(yù)處理 2h；低氧/復(fù)氧組：細(xì)胞先在低氧孵箱培養(yǎng) 24h，繼之在常氧孵箱培養(yǎng) 2h 復(fù)氧；低氧/復(fù)氧+黃芩苷組：100μmol/L黃芩苷預(yù)處理 2h 后，先在低氧孵箱培養(yǎng) 24h，繼之在常氧孵箱培養(yǎng) 2h 復(fù)氧。(A) Cell death was measured by CCK-8 assay. , p<0.05 vs. control group, #, p<0.05 vs.Baicalin group, Δ, p<0.05 vs, H/R group. &, p<0.05 vs. H/R+25μmol/L Baicalin group. Afterpretreatment with or without 100μmol/L Baicalin for 2h, HK-2 cells were treated with eithernormoxia or 24h of hypoxia followed by 2h of reoxygenation. (B) Cleaved-caspase3 expression wasdetected by western blotting. (C) Relative quantification of Cleaved-caspase3 expression in Fig. 2B.(D-F) Apoptosis was measured by flow cytometry (D, E) and TUNEL assay (F, magnification 200×).

2.2 低氧/復(fù)氧對 HK2 細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響為驗(yàn)證低氧/復(fù)氧是否可以誘導(dǎo) HK2 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，本文通過 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的 HK2 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白 BIP 和 Caspase 12 表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 3A,B,H）；同時免疫熒光檢測進(jìn)一步顯示，低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞 BIP 蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 3I,J），提示低氧/復(fù)氧可以增強(qiáng) HK2 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要包括 PERK,IRE1 和 ATF6 這三條信號通路，本文研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)后，HK2細(xì)胞PERK, ATF4和CHOP蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 3A,C-E）；但是，ATF6 和 IRE1 蛋白表達(dá)水平未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（3A,F,G），提示低氧/復(fù)氧通過激活 PERK 信號通路增加 HK2 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。


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