發(fā)布時間：2021-04-01 05:07

　　小檗堿具有一定的抗腫瘤活性,先利用基因芯片測定小檗堿的基因表達譜數據,然后與CMap數據庫作對比,預測小檗堿抗腫瘤的作用機制,再利用CCK-8法確定研究小檗堿抗腫瘤作用機制時所使用的腫瘤細胞。方法:首先用小檗堿處理MCF-7人乳腺癌細胞抽提出的RNA做基因芯片測定了小檗堿的基因表達譜數據,其中芯片類型為Affymetrix Human Genome U133A 2.0。通過小檗堿的基因表達譜數據與CMap數據庫的對比,預測小檗堿可作為一種Hsp90抑制劑,也可作為一種HDAC抑制劑,或者可通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路促進腫瘤細胞的凋亡。然后通過CCK-8法測定小檗堿對幾種實驗室常用的腫瘤細胞的抑制活性,其中對SW480人結腸癌細胞的抑制活性最好,因此后續(xù)的驗證實驗選擇SW480細胞。然后通過流式細胞儀檢測了小檗堿對SW480細胞的凋亡、線粒體膜電位以及周期的影響。又通過Cellular thermal shift檢測在SW480細胞中,小檗堿是否與Hsp90蛋白結合,通過Western blot檢測小檗堿是否影響Hsp90客戶蛋白的表達,部分在結腸癌中高表達的HDAC的幾個亞... 

【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校

【文章頁數】：67 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

小檗堿的化學結構

能夠推測出小分子藥物可能的作用機制[19]。用不同濃度（如 10nm、100nm、1μM、10μM 等）的藥物小分子處理不同的細胞株（如人皮膚黑色素瘤細胞 SKMEL-5，人乳腺癌細胞 MCF-7，人急性早幼粒白血病細胞 HL-60，人前列腺癌細胞 PC-3 等），處理的時間一般分為 6h 或者12h。處理之后將細胞收集并提取細胞中的 RNA，然后對提取的 RNA 進行純度鑒定，最后進行表達譜基因芯片實驗[20]。如果選用的細胞是 MCF-7，則可以用DMSO 處理 MCF-7 細胞作為空白對照組，用 β-雌二醇處理 MCF-7 細胞作為陽性對照組，所有樣品均獨立重復實驗 3 次，然后可以得到藥物小分子的基因表達譜數據。拿藥物小分子的基因表達譜數據與 CMap 數據庫作對比，會得到一系列化合物，這些化合物有相應的打分（即 Connectivity score）。根據所得的分數可以將這些化合物分為三類，-1 到 0 的化合物與藥物小分子的作用呈負相關，越接近-1 則說明藥物小分子與該化合物的作用相反的程度越高；反之，0 到 1 的化合物與藥物小分子的作用呈正相關，且越接近 1 說明藥物小分子與該化合物的作用越接近；如果為 0，則說明這些化合物基本上與藥物小分子沒有聯系[21]。CMap 數據庫建立的原理如圖 1.2 所示：

圖 2.1 BCA 測定的蛋白濃度標準曲線然后可以測定自己的蛋白樣品濃度，在 96 孔板中選取一定數量的孔每孔加200μL的BCA工作液，再加入2μL的蛋白樣品，每個蛋白樣品設置兩個復孔，且做好相應的標記，按照制作蛋白濃度標準曲線時的方式進行孵育，測出蛋品的 OD 值之后，與蛋白濃度標準曲線進行比對，即可計算出蛋白樣品的濃配制凝膠：先將要用于配膠的玻璃板用超純水清洗干凈，然后將其固定在架上，加入足夠量的超純水用于檢漏。15min 后，如果玻璃板中間的超純水有明顯漏掉，將配膠架倒置以使玻璃板中間的超純水流出，并用吸水紙盡量璃板中間的超純水吸收干凈。完成之后，先按照 SDS-PAGE 分離膠配方表 2.1）配制分離膠，也就是下層膠，分離膠配制所需要的濃度可以由目標蛋分子量的大小來確定，理論上分子量越小的目標蛋白應選擇濃度越高的分離。等所有成分依次加入后，將其渦旋充分混合均勻（注意時間不要過久，以在混勻的過程中凝固），然后取一定的量加入到玻璃板中間，再加入一定量

【參考文獻】：
期刊論文
[1]小檗堿抗腫瘤作用機制的研究進展[J]. 張娟,李東霞.  醫(yī)學綜述. 2014(04)
[2]小檗堿抗腫瘤研究進展[J]. 王志紅.  海峽藥學. 2004(02)



本文編號：3112724