目的 假體周圍骨溶解是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見的遠期并發(fā)癥,摩擦界面釋放的磨損顆粒導致的成骨環(huán)節(jié)的抑制及破骨環(huán)節(jié)的激活是骨溶解發(fā)生發(fā)展的重要原因。重塑正常骨代謝過程成為治療骨溶解疾病的重要策略之一。本項目擬利用天然藥物大黃素治療鈦顆粒誘導的骨溶解,明確其對于骨溶解反應中成骨及破骨環(huán)節(jié)的影響,并探討其機制。方法 提取原代巨噬細胞及原代成骨細胞分別構(gòu)建RANKL誘導的破骨細胞生成模型及磨損顆粒與成骨細胞共培養(yǎng)模型,體外模擬鈦顆粒誘導骨溶解反應中成骨及破骨環(huán)節(jié)病理過程,采用TRAP染色、細胞骨架染色、骨吸收實驗等方法評價大黃素對破骨細胞生成及功能的影響,采用ALP染色,茜素紅染色等方法評價大黃素對磨損顆粒刺激下成骨細胞成骨功能的影響,通過western blot等手段檢測MAPK,PI3K/AKT及NF-κB通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的改變,探討大黃素抑制破骨細胞生成及骨吸收功能可能的機制。在此基礎(chǔ)上,體內(nèi)構(gòu)建出小鼠顱骨骨溶解模型,采用大黃素進行干預治療,采用組織學切片及micro-CT等手段評價大黃素體內(nèi)應用對鈦顆粒誘導骨溶解的干預效果。結(jié)果 在破骨細胞實驗中,TRAP染色結(jié)果顯示大黃素顯著抑制... 

【文章來源】：上海交通大學上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CCK8測定大黃素作用于原代巨噬細胞的安全劑量范圍

圖 2 大黃素對破骨細胞生成的抑制作用。將原代巨噬細胞分別在含 30ng/ml M-CSF，100ng/ml sRANKL 和不同濃度大黃素的培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)。(A)不同濃度大黃素對破骨細胞生成的影響，（B)不同時期添加大黃素對破骨細胞生成的影響。所有實驗均獨立重復三次，相比較于對照組，*表示 p<0.05，**表示 p<0.01。所有數(shù)據(jù)均以均值±標準差形式展示。標尺=100μm。為檢驗大黃素對破骨細胞生成的抑制作用，我們將原代巨噬細胞培養(yǎng)于含sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同濃度（1.25μM，2.5μM，5μM，20μM）大黃素的 α-MEM 完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng) 7 天后，光鏡下可見對照組多核巨細胞的出現(xiàn)，并可被 TRAP 染色染為紅色，證明成熟巨噬細胞的生成。而在實驗組中，大黃素處理后使破骨細胞生成的數(shù)量及面積均顯著降低，且這一效應呈劑量依賴性。為進一步確認大黃素的藥效具體作用與破骨細胞分化的哪一時期。我們分別在破骨細胞誘導周期中的第 0-2 天，1-3 天，2-4 天及 3-5 天添加大黃素進行干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有 0-2 天及 1-3 天加藥處理后破骨細胞生成的數(shù)量及面

圖 3 大黃素對破骨細胞骨吸收功能的抑制作用。將原代巨噬細胞接種到 Corning OsteoAssay Surface 骨實驗檢測平板上，在含 sRANKL（100ng/ml）和 M-CSF（30ng/ml）的 α-MEM 完全培養(yǎng)液中誘導 4 天，見成熟破骨細胞生成后，分別加入含 sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同濃度大黃素的 α-MEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 2 天，光鏡下觀察磷酸鈣吸收情況并拍照。所有實驗均獨立重復三次，相比較于對照組，*表示 p<0.05，**表示p<0.01。所有數(shù)據(jù)均以均值±標準差形式展示。標尺=200μm。具有骨吸收能力是破骨細胞最為重要的特征，為了檢驗大黃素是否同時具有對成熟破骨細胞骨吸收功能的抑制作用，我們將原代巨噬細胞接種于含有磷酸鈣包被的 Corning OsteoAssay Surface 骨實驗檢測平板上，在破骨細胞誘導液（含 RANKL 100ng/ml，M-CSF 30ng/ml）中培養(yǎng) 4 天，待成熟破骨細胞出現(xiàn)后，添加不同濃度的大黃素再繼續(xù)培養(yǎng) 2 天，檢測骨板內(nèi)磷酸鈣被吸收的程度。結(jié)果表明，對照組（OμM 組）磷酸鈣侵蝕面積高達 38.36%，而分別經(jīng)過1.25μM，2.5μM，5μM 及 20μM 大黃素處理后，大黃素的磷酸鈣侵蝕面積下降


本文編號：2938062