目的 假體周圍骨溶解是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見(jiàn)的遠(yuǎn)期并發(fā)癥,摩擦界面釋放的磨損顆粒導(dǎo)致的成骨環(huán)節(jié)的抑制及破骨環(huán)節(jié)的激活是骨溶解發(fā)生發(fā)展的重要原因。重塑正常骨代謝過(guò)程成為治療骨溶解疾病的重要策略之一。本項(xiàng)目擬利用天然藥物大黃素治療鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解,明確其對(duì)于骨溶解反應(yīng)中成骨及破骨環(huán)節(jié)的影響,并探討其機(jī)制。方法 提取原代巨噬細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞分別構(gòu)建RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成模型及磨損顆粒與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型,體外模擬鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解反應(yīng)中成骨及破骨環(huán)節(jié)病理過(guò)程,采用TRAP染色、細(xì)胞骨架染色、骨吸收實(shí)驗(yàn)等方法評(píng)價(jià)大黃素對(duì)破骨細(xì)胞生成及功能的影響,采用ALP染色,茜素紅染色等方法評(píng)價(jià)大黃素對(duì)磨損顆粒刺激下成骨細(xì)胞成骨功能的影響,通過(guò)western blot等手段檢測(cè)MAPK,PI3K/AKT及NF-κB通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的改變,探討大黃素抑制破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能可能的機(jī)制。在此基礎(chǔ)上,體內(nèi)構(gòu)建出小鼠顱骨骨溶解模型,采用大黃素進(jìn)行干預(yù)治療,采用組織學(xué)切片及micro-CT等手段評(píng)價(jià)大黃素體內(nèi)應(yīng)用對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解的干預(yù)效果。結(jié)果 在破骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,TRAP染色結(jié)果顯示大黃素顯著抑制... 

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CCK8測(cè)定大黃素作用于原代巨噬細(xì)胞的安全劑量范圍

圖 2 大黃素對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用。將原代巨噬細(xì)胞分別在含 30ng/ml M-CSF，100ng/ml sRANKL 和不同濃度大黃素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)。(A)不同濃度大黃素對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響，（B)不同時(shí)期添加大黃素對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，相比較于對(duì)照組，*表示 p<0.05，**表示 p<0.01。所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式展示。標(biāo)尺=100μm。為檢驗(yàn)大黃素對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制作用，我們將原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同濃度（1.25μM，2.5μM，5μM，20μM）大黃素的 α-MEM 完全培養(yǎng)液中，培養(yǎng) 7 天后，光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組多核巨細(xì)胞的出現(xiàn)，并可被 TRAP 染色染為紅色，證明成熟巨噬細(xì)胞的生成。而在實(shí)驗(yàn)組中，大黃素處理后使破骨細(xì)胞生成的數(shù)量及面積均顯著降低，且這一效應(yīng)呈劑量依賴性。為進(jìn)一步確認(rèn)大黃素的藥效具體作用與破骨細(xì)胞分化的哪一時(shí)期。我們分別在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)周期中的第 0-2 天，1-3 天，2-4 天及 3-5 天添加大黃素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有 0-2 天及 1-3 天加藥處理后破骨細(xì)胞生成的數(shù)量及面

圖 3 大黃素對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的抑制作用。將原代巨噬細(xì)胞接種到 Corning OsteoAssay Surface 骨實(shí)驗(yàn)檢測(cè)平板上，在含 sRANKL（100ng/ml）和 M-CSF（30ng/ml）的 α-MEM 完全培養(yǎng)液中誘導(dǎo) 4 天，見(jiàn)成熟破骨細(xì)胞生成后，分別加入含 sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同濃度大黃素的 α-MEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 2 天，光鏡下觀察磷酸鈣吸收情況并拍照。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，相比較于對(duì)照組，*表示 p<0.05，**表示p<0.01。所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式展示。標(biāo)尺=200μm。具有骨吸收能力是破骨細(xì)胞最為重要的特征，為了檢驗(yàn)大黃素是否同時(shí)具有對(duì)成熟破骨細(xì)胞骨吸收功能的抑制作用，我們將原代巨噬細(xì)胞接種于含有磷酸鈣包被的 Corning OsteoAssay Surface 骨實(shí)驗(yàn)檢測(cè)平板上，在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（含 RANKL 100ng/ml，M-CSF 30ng/ml）中培養(yǎng) 4 天，待成熟破骨細(xì)胞出現(xiàn)后，添加不同濃度的大黃素再繼續(xù)培養(yǎng) 2 天，檢測(cè)骨板內(nèi)磷酸鈣被吸收的程度。結(jié)果表明，對(duì)照組（OμM 組）磷酸鈣侵蝕面積高達(dá) 38.36%，而分別經(jīng)過(guò)1.25μM，2.5μM，5μM 及 20μM 大黃素處理后，大黃素的磷酸鈣侵蝕面積下降


本文編號(hào)：2938062