目的本研究以山西道地藥材遠志為對象,利用現(xiàn)代提取分離方法、儀器分析鑒定技術(shù)對遠志糖蛋白類成分的提取工藝、分離純化、結(jié)構(gòu)表征及體內(nèi)外抗衰老活性進行了系統(tǒng)的分析研究,并進一步從血清代謝組學的角度,對其發(fā)揮抗衰老活性的代謝通路進行初步探索,以期為遠志藥材藥效活性物質(zhì)的研究開拓新的領(lǐng)域。方法以蛋白得率為評價指標,從p H值、溫度、鹽濃度、液料比、提取時間五個方面進行單因素試驗,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取其中影響較大的三個因素,運用響應(yīng)曲面方法考察遠志糖蛋白的最佳提取工藝。以優(yōu)選工藝得到的遠志總糖蛋白(PG)為研究對象,考察不同劑量總糖蛋白對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用,試驗結(jié)束后,測定血清及腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及丙二醛(MDA)等指標的變化情況,對總糖蛋白的抗衰老活性進行初步驗證。采用DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析對總糖蛋白進一步分離純化,以多糖和蛋白含量為指標繪制洗脫曲線,收集純化后的糖蛋白純品,經(jīng)SDS-Page電泳法驗證其純度并測定其分子量,在此基礎(chǔ)上,采用紫外光譜、紅外光譜、氨基酸自動分析等方法對其結(jié)構(gòu)組成進行初步表征。對糖蛋白純品進行體外抗氧化活性評價,包括清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力以及FRAP總還原能力。在前期體內(nèi)抗衰老試驗的基礎(chǔ)上,通過GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù),采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)、單變量統(tǒng)計分析(UVA)及差異化合物篩選、代謝通路分析等分析方法,篩選血清中與抗衰老作用相關(guān)的代謝標記物,并匹配相應(yīng)的抗衰老作用通路。結(jié)果采用p H=7.85的Tris-HCl(Na Cl濃度0.1 mol/L)緩沖液,以液料比8 m L/g、溫度33℃水浴提取1.5h條件下,蛋白得率最高,可達(5.96±0.045)%。總糖蛋白體內(nèi)抗衰老試驗結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著降低(P0.05或P0.01),血清和腦組織中SOD活力、MDA含量顯著降低(P0.05),血清中CAT活性極顯著降低(P0.01)。與模型組比較,高劑量組血清中SOD活力顯著升高(P0.05),腦組織中MDA含量極顯著降低(P0.01),中、高劑量組血清中CAT活性極顯著升高(P0.01)。分離純化結(jié)果表明,以DEAE-52為交換填料,采用不同離子強度的緩沖液進行分階段洗脫,以緩沖液Buffer D(p H=7.85 0.1mol/L Tris-HCl緩沖液含0.3 mol/L Na Cl)洗脫出來的組分,其蛋白和多糖含量成峰型對稱分布,經(jīng)SDS-Page電泳法驗證其為電泳純純度,分子量為36k D,經(jīng)紅外光譜檢測,該糖蛋白(PG-D)在3230、2930、1640、1550、1458、1030、898cm-1附近均表現(xiàn)出明顯的蛋白和多糖分子的特征吸收峰;紫外β-消除反應(yīng)前后對比顯示240nm處有吸收強度的變化,說明該糖蛋白中糖肽鍵類型為O-糖肽鍵;氨基酸自動分析結(jié)果顯示,該糖蛋白中包含18種不同類型的氨基酸,除色氨酸在酸水解過程中被破壞掉以外,其余7種人體必需的氨基酸均被檢測出來。對純品進行體外抗氧化活性結(jié)果綜合表明,在一定的濃度范圍內(nèi),遠志總糖蛋白(PG)和純品(PG-D)均具有一定的抗氧化活性,糖蛋白純品的抗氧化表現(xiàn)力介于Vc和總糖蛋白之間,VcPG-DPG。血清代謝組學結(jié)果顯示,經(jīng)OPLS-DA分析后,綜合VIP值(變量重要性投影值)1及P0.1,空白組與模型組之間、模型組與中量組之間共篩選得到6個共有差異代謝物,包括尿嘧啶核苷、塔格糖、環(huán)己基甲酰氨、糖酸、尿嘧啶、天冬酰胺,并且與空白組相比,這6種差異物均有升高的趨勢,但在遠志糖蛋白干預(yù)后又均下降,其變化趨勢反映了衰老模型的建立以及在糖蛋白干預(yù)后的代謝調(diào)節(jié)作用。遠志糖蛋白干預(yù)衰老小鼠后,將主要從嘧啶代謝、抗壞血酸代謝、泛酸鹽和輔酶A生物合成、β-丙氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、半乳糖代謝等代謝通路上發(fā)揮抗衰老作用,其中嘧啶代謝、抗壞血酸代謝、半乳糖代謝分別涉及核苷酸代謝、碳水化合物合成代謝及糖代謝,初步說明遠志糖蛋白將主要從這些代謝途徑上干預(yù)機體的衰老活動。結(jié)論采用響應(yīng)曲面方法建立的模型預(yù)測準確,可較好地優(yōu)選出遠志糖蛋白的最佳提取工藝,利用該工藝提取得到的總糖蛋白對D-半乳糖致衰老小鼠有一定的抗衰老活性,并經(jīng)血清代謝組學方法分析得到其抗衰老通路與核苷酸代謝、碳水化合物合成代謝及糖代謝等途徑相關(guān),后期對純品的初步結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性評價結(jié)果顯示,純品的抗氧化能力要強于總糖蛋白部位,上述研究結(jié)果可為遠志藥材的藥效活性物質(zhì)研究及其進一步產(chǎn)品開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。
【學位單位】：山西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

圖 1-1 蛋白質(zhì)的標準曲線線的回歸方程為：y=5.785x+0.0272 （r=0.9991），其中濃度（單位為 mg/mL，線性范圍：0.04~0.12 mg/mL）具有良好的線性關(guān)系。

圖 1-2 緩沖液 pH 值對蛋白得率的影響H 從 7 到 8 蛋白得率呈上升趨勢，大于 8 之后開始下降接影響蛋白質(zhì)的帶電情況，進而影響到蛋白質(zhì)在提取液蛋白質(zhì)的等電點偏低，故一般比較適宜采用偏堿性的條

圖 1-3 溫度對蛋白得率的影響0-40 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，糖蛋白得率不斷增加卻反而開始下降，最佳提取溫度為 40 ℃。這是因為在的升高，可加速溶劑對藥物主要成分的解吸和溶解，但[12]
【參考文獻】

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本文編號：2890142