目的:腦卒中是導致人類死亡的第二大原因,發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高且預后效果差。腦卒中的發(fā)病機制復雜,臨床上尚缺少有效的治療藥物。傳統(tǒng)的中藥驗方復元醒腦湯對腦缺血有良好的治療效果。我們通過構(gòu)建SD大鼠腦缺血再灌注損傷模型(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)和PC12細胞糖氧剝奪模型(oxygen and glucose deprivation,OGD),對復元醒腦湯及制天南星主要活性成分鹽酸水蘇堿和秋水仙堿的腦保護作用進行研究,并對鹽酸水蘇堿和秋水仙堿的作用機制進行了研究。方法:1.采用線栓法構(gòu)建SD大鼠腦缺血2h后再灌注損傷24h模型。動物隨機分為假手術(shù)組、模型組、復元醒腦湯低劑量組(5.5g/kg)、中劑量組(11g/kg)和高劑量組(22g/kg)。腦缺血15min后灌胃給藥一次。鹽酸水蘇堿(30mg/kg)和秋水仙堿(0.5mg/kg)給藥組,缺血15min后尾靜脈給藥一次。再灌注24h后對動物進行行為評分,取全血離心后取血清,檢測血清中SOD和MDA的含量變化,ELISA檢測血清中TNF-α和IL-1β的變化;取腦組織進行相關(guān)染色觀察腦組織損傷情況以及病理形態(tài)的變化和神經(jīng)細胞凋亡情況等。2.構(gòu)建PC12細胞缺糖缺氧模型,用細胞培養(yǎng)箱和缺氧裝置構(gòu)建細胞模型。實驗分為正常對照組、OGD組、鹽酸水蘇堿和秋水仙堿給藥組,缺氧前2h給予藥物治療,給藥組和OGD組放入缺氧裝置中缺氧6h,正常對照組不做處理。缺氧結(jié)束之后,MTT檢測實驗各組細胞存活情況,利用流式細胞檢測技術(shù)檢測凋亡和細胞內(nèi)ROS含量的變化情況,利用western blot方法分析了NF-κB、MAPK和JAK2-STAT3通路相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果:1.與缺血再灌注模型組相比復元醒腦湯低、中、高(5.5、11、22g/kg)劑量給藥組、鹽酸水蘇堿以及秋水仙堿給藥組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P0.05);TTC染色結(jié)果顯示復元醒腦湯給藥組腦梗死百分比與模型組相比顯著下降(P0.05);HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織細胞損傷嚴重,細胞間隙變大,細胞核皺縮,給藥各組大鼠腦組織細胞損傷減輕;TUNEL染色結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠腦組織細胞形態(tài)正常沒有棕色的凋亡細胞,與模型組相比給藥各組凋亡細胞數(shù)目減少且具有統(tǒng)計學意義(P0.05);NISSL染色結(jié)果顯示給藥各組完整神經(jīng)細胞數(shù)目較模型組增多(P0.05)。比較實驗各組血清中SOD和MDA的含量變化,給藥各組SOD的含量較模型組上升(P0.01);MDA含量較模型組有所下降(P0.05);ELISA檢測血清中TNF-α和IL-1β的變化,實驗各組較模型組均下降(P0.05)。2.MTT法檢測細胞生存率,與OGD組細胞相比,鹽酸水蘇堿和秋水仙堿給藥組細胞的生存率上升(P0.05);鹽酸水蘇堿和秋水仙堿可以減少OGD刺激引起的細胞凋亡,并且可以降低細胞內(nèi)ROS的表達(P0.05);在m RNA水平上鹽酸水蘇堿和秋水仙堿可以降低TNF-α和IL-1β的表達(P0.05),在相關(guān)異常蛋白表達上給藥組與OGD組相比得到改善(P0.05)。結(jié)論:1.復元醒腦湯能夠改善SD大鼠缺血再灌注損傷引起的行為障礙以及減少腦組織梗死面積百分比,減輕腦神經(jīng)細胞的損傷情況具有腦保護作用;鹽酸水蘇堿和秋水仙堿對腦缺血再灌注損傷也具有保護作用。2.鹽酸水蘇堿和秋水仙堿能夠提高OGD刺激后PC12細胞的生存率,減少細胞的凋亡,降低細胞內(nèi)ROS的含量,降低炎癥因子的含量,減少OGD刺激引起的細胞損傷。3.鹽酸水蘇堿和秋水仙堿可能通過降低OGD刺激后PC12細胞p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、p-p38、p-JNK蛋白的表達從而發(fā)揮保護作用。
【學位單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

.1.1 實驗動物成年健康雄性 SD 大鼠，體重（260±20）g 購于上海斯萊克實驗動物公司，實驗動物在術(shù)前飼養(yǎng) 1 周適應(yīng)環(huán)境，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學藥學院溫（25±2）℃，相對濕度 70%左右，8:00-20:00 自動照明。保持自由進實驗動物均符合實驗動物倫理學要求，實驗期間均受到人性化對待。.1.2 實驗藥物復元醒腦湯復方的組成藥材為人參10g，水蛭12g，制天南星9g，大黃(后七 15g。人參（批號：160802）購于亳州市華云中藥飲片有限公司，水：160301）、制天南星（批號：160601）、大黃（批號：160501）、三：160401）等均購于上海龍威醫(yī)藥有限公司，福建孟氏藥業(yè)有限公司生中使用的中藥材、中藥飲片的標準執(zhí)行中國藥典一部 2015 年版。鹽酸水蘇堿和秋水仙堿均購自于大連美侖生物技術(shù)有限公司，結(jié)構(gòu)式

的說明書中的介紹提前將試劑盒恢復室溫，制備標準曲線并對樣本進行檢測。1.3 統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，使用 GraphPad Prism 軟件數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，采用單因素方差分析 (One-way ANOVA）檢驗差異的顯著性以 P<0.05 為具有統(tǒng)計學意義。2 實驗結(jié)果2.1 復元醒腦湯對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用2.1.1 復元醒腦湯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)行為學評分腦缺血再灌注損傷會導致大鼠運動功能失衡，行為學發(fā)生明顯的變化，實采用神經(jīng)功能缺損評分。假手術(shù)組大鼠行為學反應(yīng)正常，模型組的行為學評分為2.70±0.13，給藥組三個劑量的大鼠行為學都得到了不同程度的改善，與假手術(shù)相比（P<0.01），低劑量組為 2.25±0.14，中劑量組為 2.00±0.12，高劑量組1.71±0.14，與模型組比較有顯著性差異（P<0.01），結(jié)果如下圖。

圖 3.復元醒腦湯對大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗死的影響 TTC 染色典型圖；B. 腦梗死百分比的影響。**P<0.01，模型組 vs.假手術(shù)組；模型組 vs.給藥組（n=10）Fig3. Effect of Fu-Yuan-Xing-Nao Decoction on cerebral infarct areas in rat brai復元醒腦湯減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的腦組織病理學改鼠腦缺血 2h 再灌注 24h 以后各實驗組 HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組層神經(jīng)細胞無明顯缺血損傷表現(xiàn)，神經(jīng)細胞形態(tài)正常，排列整齊，細胞核清晰（圖 4a）。模型組神經(jīng)細胞體積變小，細胞核出現(xiàn)皺縮間間隙變大（圖 4b）。復元醒腦湯能明顯減輕和改善缺血再灌注造結(jié)構(gòu)的損傷，其中高劑量組改善作用較為明顯。
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本文編號：2888244