目的:建立多指標同時測定牛膝的甾酮類和皂苷類化學成分的定量方法;多指標正交試驗優(yōu)選牛膝酒炙工藝;觀察牛膝甾酮皂苷化學部位和牛膝多糖抗軟骨細胞凋亡作用,多糖、甾酮皂苷化學部位配伍使用能否增效。有關實驗研究豐富牛膝質(zhì)控方法,為牛膝的酒炙飲片加工提供合理的技術參數(shù),為牛膝的深入研發(fā)提供理論基礎。方法:1.查閱文獻資料、開展預試驗,從β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro、牛膝皂苷Ⅱ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa和胡蘿卜苷中確定β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa為牛膝單體成分含量測定的指標性成分;采用HPLC法,Agilent ZORBAX SB-C_(18)色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0~18min,17%A;18~20min,17%A→32%A;20~64min,32%A;64~65min,32%A→17%A);同時測定牛膝中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量,檢測波長β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮250nm,人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 203nm;并進行相應的方法學考察。2.總甾酮以β-蛻皮甾酮為對照,采用UV法242nm波長下測定總甾酮含量;總皂苷以人參皂苷Ro為對照,香草醛-冰醋酸-高氯酸反應顯色處理,采用UV法544nm波長下測定總皂苷含量;總多糖以葡萄糖為對照品,苯酚-濃硫酸反應顯色處理,采用UV法584nm波長下測定總皂苷含量。3.選取酒種類、加酒量、悶潤時間3個考察因素,每個因素設定3個水平,采用L_9(3~4)進行正交設計,以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、總甾酮、總皂苷和總多糖為指標,綜合優(yōu)選牛膝的最佳酒炙工藝。4.按中國藥典2015年版一部牛膝項下有關規(guī)定,制備牛膝段、酒牛膝飲片,比較牛膝藥材、牛膝段、酒牛膝中甾酮類、皂苷類和多糖類成分的含量變化情況。5.根據(jù)牛膝中甾酮、皂苷和多糖的理化性質(zhì),乙醇溶液提取,大孔吸附樹脂純化,制備牛膝總甾酮皂苷化學部位;醇提后的藥渣加水煎煮,乙醇分級沉淀制備牛膝總多糖,多指標控制牛膝總甾酮皂苷、總多糖化學部位的質(zhì)量。6.大鼠灌胃7天后腹主動脈取血,制備含藥血清;培養(yǎng)C28/I2軟骨細胞系,優(yōu)化細胞鋪板數(shù)、硝普鈉造模濃度;分別加入體積分數(shù)5%、10%、15%的甾酮皂苷和多糖化學部位含藥血清與硝普鈉共培養(yǎng)24、48、72小時,確定藥物活性、給藥濃度和時間;5%以下不同濃度甾酮皂苷、多糖含藥血清配比組合,與硝普鈉共培養(yǎng)24小時,確定增效活性及藥物濃度配比;MTT法檢測細胞增殖活性。結果:1.建立了HPLC法同時測定牛膝及其炮制品中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮等3個甾酮類成分和人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa等2個皂苷類成分含量的方法,所建立的方法重現(xiàn)性好、準確率高。β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa進樣量分別在0.2180~2.7250μg(r=0.9998)、0.0796~0.9950μg(r=0.9999)、0.1548~1.9350μg(r=0.9999)、0.3520~4.4000μg(r=0.9998)和0.3380~4.2250μg(r=0.9998)范圍內(nèi)呈良好的線性關系;加樣回收率分別為98.37%、101.66%、99.09%、99.25%和101.53%,相應的RSD分別為0.87%、1.02%、1.74%、0.67%和1.28%。2.實驗中建立的牛膝總甾酮、總皂苷含量測定的方法,準確、簡便,分別在0.0260~0.0940mg/mL(r=0.9992)、0.0090~0.0990mg(r=0.9980)范圍內(nèi)呈良好的線性關系,平均加樣回收率分別為98.85%、99.32%,RSD值分別為為1.89%、1.17%。建立的總多糖含量測定方法,簡便、易行,在0.0024~0.0289mg/mL(r=0.9994)范圍內(nèi)線性關系良好。3.優(yōu)選出的牛膝最佳酒炙工藝為牛膝段加10%(g/g)黃酒悶潤60min后炒炙15min,工藝驗證表明該工藝簡便、易于控制、重復性良好。4.與牛膝藥材相比較,牛膝段飲片中甾酮類單體成分、總甾酮、總多糖的含量略有下降,而皂苷類單體成分、總皂苷的含量則明顯降低;與牛膝段相比較,牛膝酒炙后,甾酮類成分含量略有增加,人參皂苷Ro和總皂苷的含量出現(xiàn)較為明顯的增加;總多糖含量下降明顯。5.制得的三批次甾酮皂苷化學部位和多糖化學部位中5個單體成分和3種總成分的含量基本穩(wěn)定。本實驗所用制備牛膝甾酮皂苷化學部位、多糖化學部位的提取方法簡便可行,質(zhì)量穩(wěn)定。6.C28/I2細胞最佳損傷模型條件為鋪板數(shù)15×10~3個/孔,硝普鈉1mmol/L培養(yǎng)24小時,與模型組相比,牛膝甾酮皂苷、多糖含藥血清均顯著提高細胞增殖活性(P0.05);以牛膝甾酮皂苷含藥血清為基礎,配伍牛膝多糖,能顯著提高細胞增殖活性(P0.05),多糖-甾酮皂苷含藥血清最佳配比1.25%-5%。結論:本文建立了HPLC法同時測定牛膝及其炮制品中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮3個甾酮類成分、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa2個皂苷類成分的方法,UV法測定總甾酮、總皂苷和總多糖的方法,經(jīng)方法學考察以上方法均簡單、準確、有良好的穩(wěn)定性和重復性,可用于牛膝及其復方制劑的質(zhì)量評價;優(yōu)選出酒牛膝的最佳炮制工藝,簡便、易于控制、重復性良好;牛膝甾酮皂苷化學部位和多糖均具有抗軟骨細胞凋亡的作用,且兩者配伍增效明顯。
【學位單位】：河南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5;R284
【部分圖文】：

取上述牛膝段和酒牛膝樣品，分別粉碎成細粉，按第一部分“2.3.2”項下制備單體成分含量測定的供試品溶液，分別按第二部分“2.1.1”、“2.1.1”、“2.3.1備總甾酮、總皂苷、總多糖含量測定供試品溶液。按第一部分“2.1.6”項下色譜測定 5 種單體成分含量，分別按第二部分“2.1.4”、“2.2.3”、“2.3.4”項下測法測定總甾酮、總皂苷、總多糖的含量。牛膝藥材、牛膝段、酒牛膝 5 種單體成 3 種總成分含量測定結果如表 4-1，牛膝及其炮制品各成分含量比較見柱狀圖 4-1-2，HPLC 色譜圖見附圖 4-1。表 4-1 牛膝、牛膝段和酒牛膝的含量測定結果（n=3，%）編號 β-蛻皮甾酮/%25R-牛膝甾酮/%25S-牛膝甾酮/%人參皂苷 Ro/%竹節(jié)參皂苷Ⅳ a/%總甾酮/%總皂苷/%總多/%藥材0.0626 0.0150 0.0235 0.0833 0.0424 0.4101 1.5756 10.81膝段 0.0561 0.0122 0.0226 0.0580 0.02560.36021.344810.52牛膝 0.0565 0.0136 0.0228 0.0638 0.02540.3913 1.6569 7.189

圖 4-2 牛膝及其炮制品 3 個總成分含量柱狀圖附圖 3-1 可以看出，牛膝藥材呈細長圓柱形，有時稍彎曲，上端較粗，約 15～70cm，直徑約 0.4～1cm，表面呈灰黃色或淡棕色，具細微的縱皺根痕；牛膝段為圓柱形 5～10mm 的短段，外表皮灰黃色或淡棕色，有微橫長皮孔，切面平坦，淡棕色或棕色，略呈角質(zhì)樣而油潤，中心維管束白色，其外圍散有多數(shù)黃白色點狀維管束，斷續(xù)排列成 2～4 輪；酒牛膝大小相似，表面色略深，偶見焦斑，切面皮部略有膨大，筋脈點不明顯。膝藥材制成牛膝段的過程中重量變化較小，損失部分主要是蘆頭的重量后，重量變化也較小，200g 牛膝段酒炙后能得到約 193g 酒牛膝，損失部時產(chǎn)生的碎屑。實驗中，按《中國藥典》2015 年版一部牛膝項下方法制備了牛膝藥材的飲片和酒牛膝飲片。在實驗中采用 HPLC 法同時測定了牛膝及其炮制品、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮等 3 個甾酮類成分和人參皂苷 Ro、竹節(jié)

圖 6-1 牛膝有效成分保護損傷軟骨細胞時效性由相對于模型組顯著性表 6-5 可知，培養(yǎng) 24h 除混合物中濃度組、混合物高濃度組沒有顯著性差異（P＞0.05）外，其余各組均有顯著性（P＜0.05）；培養(yǎng) 48h 除多糖低濃度組、甾酮皂苷部位中濃度組、混合物中濃度組、混合物高濃度組沒有顯著性差異（P＞0.05）外，其余各組均有顯著性（P＜0.05）；培養(yǎng) 72h 多糖低濃度組、多糖-甾酮皂苷部位低濃度組、多糖-甾酮皂苷部位中濃度組有顯著性（P＜0.05），其余各組均無明顯顯著性（P＞0.05）。由牛膝有效成分保護損傷軟骨細胞時效性的圖 6-1 可以明顯看出與含藥血清共培養(yǎng) 24h，加含藥血清各組對硝普鈉損傷軟骨細胞的保護作用十分顯著，而與含藥血清共培養(yǎng) 48h，72h，保護作用不明顯，因此選用與含藥血清共培養(yǎng) 24h。2.5.2 牛膝多糖、甾酮皂苷化學部位不同配比對軟骨細胞凋亡的影響2.5.2.1 接種取生長良好的第 3 代軟骨細胞 ，以 15×103/孔接種于 96 孔板上，板的邊緣各孔分別加入 200uL PBS 緩沖液，用含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基 5%CO2，37℃培養(yǎng) 24h。2.5.2.2 干預
【參考文獻】

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本文編號：2885001