發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 14:08

　　 研究背景:結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,全球發(fā)病率和病死率分別在第三位和第四位。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因。有效的抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移是提高結(jié)腸癌患者生存率的重要措施。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT),是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤早期獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵機(jī)制。重樓皂苷Ⅶ是重樓的有效成分之一,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)重樓對肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用,但其機(jī)制尚不明確。重樓皂苷Ⅶ對結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。本課題以人結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對象,首次從細(xì)胞和動物水平研究重樓皂苷Ⅶ對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用,并初步探討重樓皂苷Ⅶ是否通過抑制其EMT機(jī)制發(fā)揮作用。目的:本課題從細(xì)胞和在體水平研究重樓皂苷Ⅶ對人結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用,初步探討其可能的作用機(jī)制。方法:通過MTT法篩選重樓皂苷Ⅶ對結(jié)腸癌HCT116和SW620細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度;劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞侵襲能力的影響。Western Blot檢測重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、Twist表達(dá)的影響;掃描電鏡觀察重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞形態(tài)變化的影響。肝臟是結(jié)腸癌最常見的轉(zhuǎn)移靶器官,故本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)脾臟注射結(jié)腸癌細(xì)胞建立實(shí)驗(yàn)性裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型,實(shí)驗(yàn)期內(nèi)觀察裸鼠一般狀態(tài)。造模術(shù)后第30天,利用IVIS小動物活體成像系統(tǒng)對造模裸鼠體內(nèi)熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測,觀察裸鼠體內(nèi)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移情況及重樓皂苷Ⅶ的作用。造模術(shù)后第31天,麻醉處死裸鼠,取出裸鼠肝臟,觀察各組裸鼠肝臟表面轉(zhuǎn)移成瘤情況及給藥干預(yù)后結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移抑制率。制備轉(zhuǎn)移瘤病理切片,HE染色觀察重樓皂苷Ⅶ對結(jié)腸癌細(xì)胞的病理形態(tài)影響。Western Blot檢測重樓皂苷Ⅶ對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、Twist表達(dá)的影響。結(jié)果:MTT結(jié)果表明,重樓皂苷Ⅶ對HCT116和SW620細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用,重樓皂苷Ⅶ對HCT116細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50值為(3.72±0.09)μM,對SW620細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50值為(3.46±0.13)μM。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對照組相比,重樓皂苷Ⅶ 0.5μM、1.0μM、2.0μM組的遷移距離明顯縮短,提示細(xì)胞遷移能力明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或者P0.01),重樓皂苷Ⅶ2.0μM組尤為明顯,其作用呈劑量依賴性。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對照組相比,重樓皂苷Ⅶ劑量依賴性抑制細(xì)胞遷移和侵襲作用(P0.01)。Western Blot檢測結(jié)果表明,與對照組相比,重樓皂苷Ⅶ 0.5μM、1.0μM、2.0μM組上皮樣標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯升高,間質(zhì)樣標(biāo)志蛋白N-cadherin和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist表達(dá)明顯降低,表明重樓皂苷Ⅶ抑制了細(xì)胞的EMT。掃描電鏡結(jié)果表明,與對照組相比,重樓皂苷Ⅶ 0.5μM、1.0μM、2.0μM組的細(xì)胞均由多角伸展形、梭形轉(zhuǎn)變成圓形,偽足長度變短、數(shù)量減少,細(xì)胞間連結(jié)松散、間隙增大,且劑量越大影響越顯著,提示重樓皂苷Ⅶ抑制了細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)改變。經(jīng)脾臟注射法建立實(shí)驗(yàn)性裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型術(shù)后第30天,活體成像檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),裸鼠肝臟區(qū)檢測到陽性信號在模型對照組為100%,5.0 mg/kg 5-FU、2.5 mg/kg重樓皂苷Ⅶ和5.0 mg/kg重樓皂苷Ⅶ治療組分別為60%、40%和20%。提示腫瘤接種早期即開始應(yīng)用5-FU及重樓皂苷Ⅶ可抑制HCT116細(xì)胞向肝臟的轉(zhuǎn)移,且較大劑量重樓皂苷Ⅶ抑制效果優(yōu)于陽性對照5-FU。造模術(shù)后第31天,麻醉處死裸鼠并取出肝臟,發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的裸鼠肝臟肉眼可見白色或灰黃色轉(zhuǎn)移瘤,多見于肝臟邊緣,肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率同活體成像結(jié)果。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤病理切片各組鏡下均可見大量腫瘤細(xì)胞,異型性明顯,5-FU和重樓皂苷Ⅶ均引起腫瘤組織中央?yún)^(qū)域不同程度壞死,其中5.0 mg/kg重樓皂苷Ⅶ治療組腫瘤組織內(nèi)壞死程度最為嚴(yán)重,可見大片狀凝固性壞死。Western Blot檢測結(jié)果表明,與模型對照組相比,2.5 mg/kg重樓皂苷Ⅶ和5.0 mg/kg重樓皂苷Ⅶ治療組上皮樣標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯升高,間質(zhì)樣標(biāo)志蛋白N-cadherin及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist表達(dá)明顯降低,提示重樓皂苷Ⅶ通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞EMT而抑制其轉(zhuǎn)移。結(jié)論:重樓皂苷Ⅶ在體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對人結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲均有抑制作用,其作用機(jī)制可能是通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ結(jié)構(gòu)式及分子式3. 重樓皂苷的抗腫瘤作用機(jī)制近年來許多學(xué)者對重樓皂苷的生物活性及其作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究和探索，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷具有多種抗腫瘤功效，例如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤血管生長以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥等。3.1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡（apoptosis）是一種基本的生物現(xiàn)象，在維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)系統(tǒng)器官生長發(fā)育，甚至在生物體的進(jìn)化過程中均可發(fā)揮重要作用。對于多細(xì)胞生物體來說，細(xì)胞的增殖和凋亡始終保持著動態(tài)平衡，而對于腫瘤細(xì)胞來說，其細(xì)胞凋亡過程受到了一定程度的抑制，但是腫瘤細(xì)胞的增殖過程卻未受影響，因此細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，系統(tǒng)器官的生長和發(fā)育出現(xiàn)異常。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為了腫瘤研

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 19.0 對結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ±s）表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)， P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 重樓皂苷 VII 抑制 HCT116 和 SW620 細(xì)胞的增殖結(jié)果表明，重樓皂苷 VII 對HCT116和SW620細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，經(jīng) GraphPad Prism7.0 計(jì)算，重樓皂苷 VII 對 HCT116 細(xì)胞（A）半數(shù)抑制濃度 IC50值為（3.72 ±0.09）μM，對 SW620 細(xì)胞（B）半數(shù)抑制濃度 IC50 值為（3.46 ±0.13）μM。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。如圖 2-1 所示。

38圖 2-2 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察重樓皂苷Ⅶ對 HCT116 和 SW620 細(xì)胞遷移能力的影響A）HCT116 細(xì)胞各組劃痕 24h 后愈合情況；（B）HCT116 細(xì)胞各組劃痕 24h移距離及統(tǒng)計(jì)結(jié)果；（C）SW620 細(xì)胞各組劃痕 24h 后愈合情況；（D）SW6胞各組劃痕 24h 后遷移距離及統(tǒng)計(jì)結(jié)果(100×)。數(shù)據(jù)以 x ±s 表示，n=3，*P<0s. Control，**P<0.01 vs. Control。
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本文編號：2884839