目的:研究黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)對(duì)RAW264.7小鼠源性巨噬細(xì)胞和EAC荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,以及APS對(duì)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)RAW264.7小鼠源性巨噬細(xì)胞經(jīng)APS刺激處理后,收集細(xì)胞上清液,Griess法和ELISA法分別檢測(cè)上清液中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70的濃度;提取細(xì)胞總mRNA和總蛋白,qRT-PCR和Western Blots檢測(cè)TLR4信號(hào)通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因和蛋白的表達(dá)變化。在阻斷劑組加入TAK-242或ST-2825預(yù)處理細(xì)胞后加入APS,ELISA法檢測(cè)上清液中TNF-α和IL-6表達(dá)的變化。采用正常對(duì)照組(C57BL/10J和C57BL/6J)和基因缺陷型(C57BL/10ScNJ TLR4缺陷和C57BL/B6.129P2(SJL)-Myd88m1.1Defr/J MyD88缺陷)小鼠構(gòu)建EAC荷瘤小鼠乳腺癌動(dòng)物模型,分為生理鹽水組、阿霉素(ADM)組、APS組和LPS組,處理25天后,經(jīng)頸椎脫臼法處死小鼠,收集小鼠眼球血應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子;取實(shí)體瘤、脾臟和胸腺,稱重后統(tǒng)計(jì)瘤重和臟器指數(shù),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡率。qRT-PCR和Western Blots檢測(cè)脾臟組織中TLR4信號(hào)通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:APS顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P0.05),對(duì)IL-12p70無顯著作用(P0.05)。巨噬細(xì)胞在阻斷劑TAK-242和ST-2825的干預(yù)下,APS對(duì)NO及細(xì)胞因子分泌的促進(jìn)作用顯著降低(P0.05)。在正常對(duì)照組荷瘤小鼠中,APS顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡率、臟器指數(shù)和外周血中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的分泌,減低瘤重(P0.05),對(duì)外周血中IL-12p70的分泌無顯著作用(P0.05)。qRT-PCR和Western Blots結(jié)果顯示,APS在體外巨噬細(xì)胞和正常對(duì)照組的荷瘤小鼠中均可以顯著刺激TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB和AP-1的表達(dá)(P0.05),對(duì)TRAM的表達(dá)無顯著作用(P0.05)。在基因缺陷型荷瘤小鼠中,APS對(duì)瘤重、腫瘤凋亡率、臟器指數(shù)及細(xì)胞因子均無顯著作用,TLR4信號(hào)通路下游相關(guān)節(jié)點(diǎn)表達(dá)無明顯變化(P0.05)。結(jié)論:TLR4-MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是APS發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

因素方差分析和獨(dú)立樣本 t-檢驗(yàn)等方法分析。結(jié)果異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AW264.7 巨噬細(xì)胞一氧化氮（NO）分泌水平 鼠源性巨噬細(xì)胞株在體外培養(yǎng)的環(huán)境下，觀察黃芪將處于對(duì)數(shù)期的 RAW264.7 細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、。體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)之后，分別收集 4h、8h、1時(shí)間點(diǎn)的上清液，用 Griess 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中一顯示（如圖 1.1 所示），與陰性對(duì)照組相比，APS 的分泌(P<0.05)，并且呈時(shí)間依賴性；在 16h 到 24

圖 1.3APS 對(duì) TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因及蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 1.3 Effects of APS on TLR4 signaling pathway in RAW 264.7 cells.* P<0.05 vs. Control group.2.4 特異性分子阻斷劑反向驗(yàn)證 APS 對(duì)細(xì)胞中 TLR4 通路的作用體外培養(yǎng) RAW264.7 巨噬細(xì)胞，如方法部分 1.2.6 所述，提前孵育 TAK-242（TLR4 特異性阻斷劑）或 ST-2825（MyD88 分子阻斷劑），各組經(jīng)過處理后收集細(xì)胞上清液，ELISA 檢測(cè)上清液中 IL-6 和 TNF-α 的分泌情況。結(jié)果顯示：在未加阻斷劑組中，與 Control 組相比，APS 可以顯著促進(jìn) RAW264.7 巨噬細(xì)胞分泌 IL-6和 TNF-α 的分泌（P<0.05）；在兩個(gè)阻斷劑組（TAK-242 組和 ST-2825 組）中，APS 組與 Control 組的兩種細(xì)胞因子水平并無顯著差異（P>0.05）。此外，在兩個(gè)阻斷劑組中，APS 組的兩種細(xì)胞因子均顯著低于未加阻斷劑組的 APS 組（P<0.05）。

圖 1.4、APS 對(duì) RAW264.7 巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平的影響Fig. 1.4. Effects of APS on the cytokines secresion of RAW 264.7 cells.The reported values are the mean±SD, n=3. *, P<0.05, ** P<0.01. #, P<0.05, ## P<0.01.3 討論經(jīng)大量研究證實(shí)，黃芪多糖（APS）具有多種免疫調(diào)節(jié)的功效。APS 可以抑制CD4+CD25+調(diào)理型 T 細(xì)胞增殖[10]，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分化成熟[6]，調(diào)節(jié) Th1/Th2 細(xì)胞亞群的免疫失衡，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞系的成熟分化[11, 12]以及增加巨噬細(xì)胞的吞噬活性[12]。巨噬細(xì)胞作為特異性抗原提呈細(xì)胞，通過吞噬病原體、處理提呈抗原和釋放活性介質(zhì)參與抗感染抗腫瘤非特異性免疫防御，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)起到重要的調(diào)節(jié)作用[13-15]。激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和殺死腫瘤細(xì)胞及病原體的方式主要有
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