目的:惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一大類疾病,具有較高的發(fā)病率和致死率。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)具有強(qiáng)大的自我更新、抗凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力等特異性生物學(xué)行為,因此它們被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的“種子”。隨著腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為研究的不斷深入,越來越多的證據(jù)表明CSCs的生物學(xué)行為不單純受到一個(gè)基因、一個(gè)通路的調(diào)控,而是受控于一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)體系。經(jīng)過幾十年中醫(yī)藥防治腫瘤的探索與實(shí)踐,大量的臨床研究證明了中醫(yī)藥在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移方面有明顯的優(yōu)勢。在理論研究方面,林洪生教授基于對腫瘤發(fā)病“虛”、“毒”、“瘀”等病理因素的認(rèn)識(shí),在繼承總結(jié)“扶正培本”的基礎(chǔ)上提出了中醫(yī)藥防治腫瘤的“固本清源”新理論。中醫(yī)藥對腫瘤的治療一方面要護(hù)機(jī)體“正氣”,提高患者的防病抗病能力,糾正正氣不足的病理狀態(tài)來“固本”;另一方面祛除腫瘤發(fā)生,發(fā)展的致病因素,從源頭上控制形成腫瘤的“邪毒”以“清源”來預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究表明腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤發(fā)病乃至進(jìn)展的最根本的“種子”,因此中醫(yī)藥很可能通過清除腫瘤干細(xì)胞而達(dá)到從源頭上控制腫瘤的目的。而活血化瘀法是基于中醫(yī)“固本清源”理論防治腫瘤的主要治法之一,因此可能通過干預(yù)腫瘤干細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)防治腫瘤的作用。本研究基于中醫(yī)活血化瘀法,通過探索丹參的提取物隱丹參酮對DU145前列腺癌細(xì)胞、分離及純化的前列腺癌干細(xì)胞的干預(yù)作用,深入探討隱丹參酮網(wǎng)狀調(diào)控前列腺癌干細(xì)胞的作用機(jī)制,利用蛋白芯片的高通量方法揭示中藥單體多靶點(diǎn)、復(fù)雜干預(yù)的抗腫瘤特點(diǎn),豐富“固本清源”的理論內(nèi)涵,從而試圖應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制研究還原中醫(yī)理論,為今后進(jìn)一步研究中藥對腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的干預(yù)作用及其分子機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。方法:為了探索和明確丹參提取物隱丹參酮對前列腺癌干細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制,我們選擇了由激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞DU145培養(yǎng)純化的前列腺癌干細(xì)胞為主要模型,研究了隱丹參酮在激素非依賴型前列腺癌中的干預(yù)作用及機(jī)制。1.DU145前列腺癌細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)、純化及鑒定。選擇人前列腺癌DU145細(xì)胞系,應(yīng)用無血清懸浮球狀培養(yǎng)的方法獲得腫瘤干細(xì)胞并進(jìn)一步純化、富集,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)CD44/CD24進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞的表型鑒定,并采用異種移植實(shí)驗(yàn),將DU145細(xì)胞和DU145-CSC(前列腺癌干細(xì)胞)接種到NOD/SCID小鼠雙側(cè)腋下,觀察成瘤速度及成瘤率,評價(jià)前列腺癌干細(xì)胞的成瘤能力這一生物學(xué)行為。2.前列腺癌干細(xì)胞特異性生物學(xué)行為網(wǎng)狀調(diào)控機(jī)制研究。應(yīng)用蛋白芯片檢測的分析方法比較DU145與DU145-CSC兩種細(xì)胞的蛋白磷酸化的差異表達(dá),對前列腺癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,明確腫瘤干細(xì)胞具有強(qiáng)大自我更新能力、抗凋亡能力等生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制。3.不同中藥單體對DU145前列腺癌細(xì)胞及前列腺癌干細(xì)胞的增殖干預(yù)作用。3.1基于活血解毒法篩選有效的中藥單體。5種不同的中藥單體:隱丹參酮、莪術(shù)醇、姜黃素、貝母素甲、藤黃酸,按濃度梯度分別處理DU145細(xì)胞,24h、48h、72h后用CCK8檢測活細(xì)胞比例。3.2隱丹參酮對前列腺癌干細(xì)胞的增殖干預(yù)作用。以不同濃度的隱丹參酮處理三代以上懸浮培養(yǎng)獲得的前列腺癌干細(xì)胞球,6h、12h、24h、48h、72h、96h用CCK8法檢測活細(xì)胞比例。3.3藤黃酸對前列腺癌干細(xì)胞的增殖干預(yù)作用。以不同濃度的藤黃酸處理三代以上懸浮培養(yǎng)獲得的前列腺癌干細(xì)胞球,6h、12h、24h、48h、72h、96h后用CCK8法檢測活細(xì)胞比例。4.隱丹參酮對前列腺癌干細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。以3.46μM、6.91μM、13.82μM隱丹參酮處理DU145-CSC細(xì)胞48小時(shí)后,用AV/PI將細(xì)胞染色,流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞比例。5.隱丹參酮對前列腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞周期的干預(yù)作用。以3.46μM、6.91μM、13.82μM隱丹參酮處理DU145-CSC細(xì)胞48小時(shí)后,用PI將細(xì)胞染色,流式細(xì)胞儀檢測各周期細(xì)胞所占比例。6.隱丹參酮干預(yù)前列腺癌干細(xì)胞特異性生物學(xué)行為網(wǎng)狀調(diào)控機(jī)制研究。應(yīng)用蛋白芯片檢測的分析方法比較DU145-CSC與隱丹參酮干預(yù)后CT-CSC兩種細(xì)胞的蛋白磷酸化的差異表達(dá),探索隱丹參酮干預(yù)DU145-CSC的機(jī)制。7.隱丹參酮對前列腺癌干細(xì)胞體內(nèi)干預(yù)作用及機(jī)制研究。予NOD/SCID小鼠腋下接種人前列腺癌腫瘤干細(xì)胞,建立前列腺癌異種移植模型,干預(yù)組選擇6.25mg/kg的隱丹參酮腹腔注射隔日一次,連續(xù)4周,每周檢測小鼠瘤體體積及小鼠體重,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱取瘤重,留取瘤體組織,觀察其抑瘤率,并應(yīng)用Western Blot方法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平來探索其體內(nèi)作用機(jī)制。結(jié)果:1.應(yīng)用無血清懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)的干細(xì)胞微球具有前列腺癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志和較強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力。1.1 DU145細(xì)胞無血清培養(yǎng)7天形成的干細(xì)胞微球(Tumor Spheres),傳代三次以上Tumor Spheres獲得相對純化。流式細(xì)胞儀對DU145細(xì)胞及Tumor Spheres進(jìn)行CD44+CD24-/low表型評價(jià),DU145組CD44+CD24-/low表面標(biāo)記檢測結(jié)果為(35.45±5.05)%,而第三代 TumorSpheres 為(74.16±6.25)%(P0.01)。1.2建立小鼠異種移植模型,比較DU145和Tumor Spheres的體內(nèi)成瘤能力,Tumor Spheres成瘤時(shí)間要早于DU145細(xì)胞,且隨著時(shí)間推移,增殖速度也快于DU145細(xì)胞。從成瘤率來看,2×103數(shù)量級(jí)最能體現(xiàn),第30天時(shí)Tumor Spheres成瘤率為100%,而DU145細(xì)胞為20%,證實(shí)Tumor Spheres具有腫瘤干細(xì)胞特性。2.前列腺癌干細(xì)胞特異性生物學(xué)行為網(wǎng)狀調(diào)控機(jī)制研究。應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)比較DU145與DU145-CSC兩種細(xì)胞的蛋白磷酸化的差異表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)將“CSC”與“DU145”比較,在設(shè)置了cut off值:1.2(即ratio1.2和ratio0.833的蛋白)時(shí),得到125個(gè)差異磷酸化蛋白,其中上調(diào)磷酸化蛋白98個(gè),下調(diào)磷酸化蛋白27個(gè),通過在線數(shù)據(jù)庫KEGG分別映射到腫瘤相關(guān)信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)是以JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK/ERK為核心的信號(hào)通路的蛋白磷酸化表達(dá)存在差異。3.體外觀察隱丹參酮、藤黃酸、貝母素甲、莪術(shù)醇、姜黃素對DU145及(或)DU145-CSC的抑制率。3.1隱丹參酮對DU145細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,呈濃度與時(shí)間依賴性,其中48小時(shí)IC50為6.91μM,在6.25μM-50μM干預(yù)72小時(shí)后抑制作用達(dá)到最強(qiáng),抑制率為95%。藤黃酸對DU145細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,呈濃度依賴性,其中 48 小時(shí) IC50 為 0.65μM,3.13μM-25μM 在 48h 和 72h 對 DU145 細(xì)胞的增殖抑制作用最明顯,抑制率接近100%。貝母素甲和莪術(shù)醇對DU145細(xì)胞增殖沒有較強(qiáng)的抑制作用,不同濃度在干預(yù)時(shí)間內(nèi)抑制率均不大于50%。姜黃素對DU145細(xì)胞增殖有一定的抑制作用,48小時(shí)IC50為19.99μM,且隨著時(shí)間的延長,對細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯。3.2隱丹參酮對DU145-CSC細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,基本呈濃度和時(shí)間依賴性,其中48小時(shí)IC50為4.093μM,在6.25uM-25μM干預(yù)72-96h后,抑制率接近100%。藤黃酸對DU145-CSC細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,呈濃度和時(shí)間依賴性,其中48小時(shí)IC50為0.388μM,在1.56μM-12.5μM濃度作用48小時(shí)后抑制率接近100%。與DU145細(xì)胞相比,隱丹參酮、藤黃酸對DU145-CSC有著更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用。4.應(yīng)用不同濃度的隱丹參酮干預(yù)DU145-CSC,觀察其對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示當(dāng)3.46μM,6.91μM和13.82μM隱丹參酮干預(yù)48小時(shí)后,隱丹參酮促進(jìn)DU145-CSC細(xì)胞凋亡,且呈劑量依賴性,各劑量的隱丹參酮干預(yù)后,細(xì)胞凋亡率與對照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(對照組早期+中晚期凋亡比例:7.27±3.34%,3.46μM組早期+中晚期凋亡比例:34.82±9.83%,6.91μM組早期+中晚期凋亡比例:42.72±11.58%,13.82μM組早期+中晚期凋亡比例:48.34±10.73%,p0.01)。5.應(yīng)用不同濃度的隱丹參酮干預(yù)DU145-CSC,觀察其對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示當(dāng)3.46 μM,6.91μM和13.82 μ隱丹參酮干預(yù)48小時(shí)后,藥物干預(yù)組分別有(66.43±0.20)%,(66.63±0.63)%和(71.95±1.64)%的細(xì)胞阻滯在 G0/G1期。而未用藥物干預(yù)的對照組G0/G1期的細(xì)胞比例為(56.56±0.49)%(p0.01)。6.隱丹參酮干預(yù)前列腺癌干細(xì)胞特異性生物學(xué)行為網(wǎng)狀調(diào)控機(jī)制研究。應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)比較隱丹參酮干預(yù)后CSC(CT-CSC)與CSC的蛋白磷酸化的差異表達(dá)來探索隱丹參酮干預(yù)前列腺癌干細(xì)胞特異性生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制,結(jié)果將“CT-CSC”與“CSC”比較,發(fā)現(xiàn)隱丹參酮干預(yù)后通過在線數(shù)據(jù)庫KEGG分別映射到腫瘤相關(guān)信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)是以PI3K/AKT為核心的信號(hào)通路的蛋白磷酸化表達(dá)下調(diào),具體:FAK(Phospho-Tyr861、Phospho-Tyr397)、Pyk2(Phospho-Tyr402)、Akt(Phospho-Ser473)、CREB(Phospho-Ser133)、BCL-2(Phospho-Ser70)、p70S6 Kinase(Phospho-Ser424)、14-3-3 zeta(Phospho-Ser58)等蛋白磷酸化水平下調(diào)。7.隱丹參酮對前列腺癌干細(xì)胞體內(nèi)干預(yù)作用及機(jī)制研究。選擇中藥丹參的提取物隱丹參酮體內(nèi)干預(yù)荷瘤小鼠,隱丹參酮抑瘤率為35.4%,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)隱丹參酮干預(yù)組 FAK、p-FAK、PYK2、p-PYK2、p-AKT、p-CERB、p-BCL-2蛋白表達(dá)水平較對照組下降(P0.05)。結(jié)論:1.通過表型鑒定及成瘤能力檢測可以認(rèn)為DU145前列腺癌細(xì)胞系能夠培養(yǎng)分離前列腺癌干細(xì)胞(DU145-CSC),且高表達(dá)CD44+CD24-/low表型,并具有強(qiáng)大的自我更新能力和成瘤能力等特異性生物學(xué)行為;2.DU145-CSC 細(xì)胞中以 JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK/ERK 為核心的互有交通的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系的激活狀態(tài)調(diào)控其特異性生物學(xué)行為;3.隱丹參酮可以干預(yù)DU145-CSC的生物學(xué)行為,在體外抑制DU145-CSC的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期,體內(nèi)可以抑制DU145-CSC荷瘤小鼠的成瘤。4.隱丹參酮干預(yù)DU145-CSC生物學(xué)行為與其對PI3K/AKT為核心的網(wǎng)狀體系的調(diào)控有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

結(jié)果??１經(jīng)培養(yǎng)純化后前列腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞ＴｕｍｏｒＳｐｈｅｒｅｓ的形成實(shí)驗(yàn)??在ＳＳＭ中，ＤＵ１４５細(xì)胞呈貼壁生長，見圖１．１Ａ。當(dāng)接種于低吸附培養(yǎng)板的??ＳＦＭ中，可見一部分細(xì)胞開始凋亡壞死，剩余少部分細(xì)胞懸浮并形成較松散的??細(xì)胞團(tuán)，５－７天時(shí)可見細(xì)胞形成干細(xì)胞微球（Ｔｕｍｏｒ?Ｓｐｈｅｒｅｓ）。鏡下觀察Ｔｕｍｏｒ??Ｓｐｈｅｒｅｓ呈圓球體，微球內(nèi)細(xì)胞連接緊密，具有折光性，傳代三次以上Ｔｕｍｏｒ??Ｓｐｈｅｒｅｓ獲得相對純化，通過形態(tài)觀察可以認(rèn)為ＤＵ１４５細(xì)胞經(jīng)ＳＦＭ條件下培養(yǎng)，??可形成前列腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，并具有自我更新特性（如圖１．１Ｂ所示），其純度??需進(jìn)一步以表型檢測進(jìn)行評價(jià)。??４４??

?丹參提取物對人前列腺癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的干預(yù)作用及機(jī)制研究???ｃ）離心管中換入新的Ｍｉｌｌｉ－Ｑ，震搖管子１０ｓ，倒掉Ｍｉｌｌｉ－Ｑ。??ｄ）重復(fù)１０次。??６）離心干燥芯片表面。??７）掃描芯片。??結(jié)果??１．雜交后的芯片使用ＧｅｎｅＰｉｘ?４０００Ｂ掃描儀進(jìn)行掃描，掃描獲得的結(jié)果如下：??

用粉色填充在通路中展示，表示這些蛋白的磷酸化水平發(fā)生了變化，分別是??以ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ為核心的相關(guān)信號(hào)通路的蛋白磷酸??化表達(dá)存在差異。（見
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本文編號(hào)：2881424