目的通過觀察清開靈對小鼠腦缺血/再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,I/R)的保護作用,及對血腦屏障相關(guān)通路的影響,并從血腦屏障的干預(yù)作用角度探討其抗腦缺血的作用機制。方法1.雄性C57bl/6小鼠130只,隨機分成四組:假手術(shù)(Sham)組、模型缺血(Ischemia)組、清開靈(QKL)組(3ml·kg~(-1))、依達拉奉(EDA)組(3ml·kg~(-1))。通過制備MCAO小鼠模型,采用神經(jīng)功能評分法評定神經(jīng)功能缺損;TTC染色法測定腦梗死體積;HE染色法,觀察神經(jīng)膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化;尼氏染色法,觀察尼氏小體的情況。進而探究清開靈對小鼠I/R的保護作用。2.雄性C57bl/6小鼠120只,隨機分成四組:假手術(shù)(Sham)組、模型缺血(Ischemia)組、清開靈(QKL)組(3ml·kg~(-1))、依達拉奉(EDA)組(3ml·kg~(-1)),通過制備MCAO小鼠模型,通過雙光子顯微鏡活體動態(tài)觀察微血管結(jié)構(gòu)形態(tài),采用伊文思藍實驗觀察血腦屏障通透性,通過透射電鏡觀察血腦屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu),經(jīng)western-blot、免疫組化法,檢測缺血半球腦組織中與血腦屏障相關(guān)抗體(HIF-1α、MMP-9、occludin,ZO-1,和claudin-5)的表達情況,從血腦屏障的干預(yù)作用角度揭示清開靈有效成分抗腦缺血的作用機制。結(jié)果神經(jīng)功能評分:假手術(shù)組無神經(jīng)功能損傷行為,在腦缺血再灌注(I/R)24小時后進行神經(jīng)功能缺損評分在。結(jié)果顯示,與假手術(shù)組(Sham組)相比,模型缺血組(Ischemia組)的評分在24小時顯著增加。然而,在用清開靈(QKL)或依達拉奉(EDA)處理后,QKL組和EDA組中的小鼠具有顯著低于缺血組小鼠的評分(P0.001)。這些結(jié)果表明,QKL以指示腦梗塞體積減少的方式改善神經(jīng)功能缺損。TTC染色:通過TTC染色Sham組呈現(xiàn)出分布均勻的紅色,而Ischemia組則出現(xiàn)了顯著的缺血灶。與Ischemia相比較,I/R 24小時后,經(jīng)QKL處理的小鼠能明顯的減少腦梗死體積且與EDA具有相同的功效(P0.001)。血腦屏障作為神經(jīng)血管單元的一部分,故接下來的實驗主要研究QKL對大腦神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的的保護作用。HE染色:Sham組腦組織無明顯病理改變,細胞形態(tài)正常神,經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞排列整齊有序,胞核大,染色質(zhì)排布均勻,核仁清晰;Ischemia組見大片梗死區(qū),為液化性的壞死(軟化灶),神經(jīng)細胞大片消失,壞死區(qū)內(nèi)可見多量膠質(zhì)細胞增生;壞死邊緣(半暗帶)較窄,可見多量中粒細胞浸潤。神經(jīng)細胞,固縮成三角形,胞核染色較深;QKL組和EDA組神經(jīng)元數(shù)目輕度減少,呈輕度變性,紅色神經(jīng)元較多,小膠質(zhì)細胞增生不明顯。尼氏染色:Sham組神經(jīng)膠質(zhì)細胞排列整齊有序,未見水腫,清晰可見胞體、核仁,尼氏小體多見。Ischemia組尼氏小體明顯減少,其中部分神經(jīng)細胞核出現(xiàn)固縮深染。給藥QKL和EDA干預(yù)后,可見梗死面積減少,結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元數(shù)量較多,變性壞死的范圍相對較小。統(tǒng)計結(jié)果顯示,EDA和QKL組中Nissl染色的凋亡神經(jīng)元細胞的數(shù)量顯著低于Ischemia組(P0.001)。缺血側(cè)大腦皮層微血管結(jié)構(gòu)的觀察:在這里我們顯示腦缺血后血腦屏障功能障礙中微血管結(jié)構(gòu)的破壞。Sham組顯示血管通暢,而Ischemia組顯示節(jié)點樣收縮變形。QKL和EDA組顯著減輕腦缺血后的腦血管系統(tǒng),腦缺血24小時后較4小時血管形態(tài)變化更嚴重。血腦屏障通透性變化:我們的定量結(jié)果顯示,腦缺血再灌注24小時后,與Sham組相比,Ischemia的EB含量顯著增加,表明腦缺血再灌注后BBB的通透性增加。然而,在24小時用QKL或EDA處理后,與Ischemia組相比,同側(cè)半球的小鼠EB含量顯著降低。這種方法產(chǎn)生的結(jié)果表明QKL可以減弱BBB的破壞和對腦缺血再灌注小鼠的BBB具有保護作用。血腦屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu)改變:使用透射電子顯微鏡將來自每個處理組的三只小鼠隨機分配用于緊密連接的超微結(jié)構(gòu)觀察研究。Sham組的兩個相鄰內(nèi)皮細胞之間的緊密連接表現(xiàn)為單獨的細胞膜的典型增厚的暗線,代表連接蛋白的正常表達。相比之下,Ischemia組小鼠的緊密連接明顯受損,連接蛋白層更薄。內(nèi)皮細胞也變得水腫,并顯示細胞質(zhì)空泡化和線粒體變性。QKL組和EDA組的緊密連接異常超微結(jié)構(gòu)明顯減弱,表明QKL/EDA處理減弱了腦缺血再灌注引起的緊密連接損傷血腦屏障相關(guān)抗體的表達:本研究在I/R模型中,通過Western-Blot和免疫組化的檢測方法證明了I/R能夠誘發(fā)HIF-1α,激活HIF-1α/MMP-9通路,一方面腦缺血再灌注后高表達的HIF-1α可以促進MMP-9的表達升高,另一方面,高表達的MMP-9可以促進緊密連接蛋白occludin,ZO-1,和claudin-5降解。QKL和陽性藥EDA干預(yù)后可以減少HIF-1α和MMP-9的表達,增加occludin,ZO-1,和claudin-5的表達,促進血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù),減輕血腦屏障的破壞。結(jié)論1.清開靈能縮小MCAO小鼠的腦梗死體積,提高神經(jīng)功能評分,改善腦組織的病理損害,提示清開靈對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。2.小鼠腦缺血再灌注損傷24小時后,清開靈干預(yù)后減輕了腦缺血后微血管形態(tài)的改變和血腦屏障的通透性,且對緊密連接的超微結(jié)構(gòu)有改善作用,表明清開靈可以減輕血腦屏障的破壞,對血腦屏障有保護作用。3.小鼠腦缺血再灌注損傷24小時后,HIF-1α的表達顯著增加,激活了HIF-1α/MMP-9通路。給藥干預(yù)后可以減少HIF-1α和MMP-9的表達,增加了緊密連接蛋白occludin,ZO-1,和claudin-5的表達,提示清開靈促進血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

假手術(shù)組無神經(jīng)功能損傷行為,在腦缺血再灌注(I/R)24小時后進行神經(jīng)功能缺損評分在。結(jié)果顯示,與假手術(shù)組(Sham組)相比,模型缺血組(Ischemia組)的評分在24小時顯著增加。然而,在用清開靈(QKL)或依達拉奉(EDA)處理后,QKL組和EDA組中的小鼠具有顯著低于缺血組小鼠的評分(P<0.001)。這些結(jié)果表明,QKL以指示腦梗塞體積減少的方式改善神經(jīng)功能缺損。結(jié)果見圖1-1。2.2 QKL對腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死體積的影響

通過TTC染色Sham組呈現(xiàn)出分布均勻的紅色,而Ischemia組則出現(xiàn)了顯著的缺血灶。與模型組相比較,I/R 24小時后,經(jīng)QKL處理的小鼠能明顯的減少腦梗死體積且與EDA具有相同的功效(P<0.001)。血腦屏障作為神經(jīng)血管單元的一部分,故接下來的實驗主要研究QKL對大腦神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的的保護作用。結(jié)果見圖1-2。2.3HE染色

Sham組腦組織無明顯病理改變,細胞形態(tài)正常神,經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞排列整齊有序,胞核大,染色質(zhì)排布均勻,核仁清晰,Ischemia組見大片梗死區(qū),為液化性的壞死(軟化灶),神經(jīng)細胞大片消失,壞死區(qū)內(nèi)可見多量膠質(zhì)細胞增生;壞死邊緣(半暗帶)較窄,可見多量中粒細胞浸潤。神經(jīng)細胞,固縮成三角形,胞核染色較深。QKL組和EDA組神經(jīng)元數(shù)目輕度減少,呈輕度變性,紅色神經(jīng)元較多,小膠質(zhì)細胞增生不明顯。結(jié)果見圖1-32.4尼氏染色
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本文編號：2879474