目的:肺纖維化(Pulmonary Fibrosis,PF)是一類以間質(zhì)性炎癥和肺間質(zhì)纖維化為主要病變的間質(zhì)性肺疾病。病理表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積,臨床表現(xiàn)為呼吸困難和正常肺功能喪失等。PF發(fā)病演變可分為氧化應(yīng)激、肺泡炎和纖維化階段。丹參主要含有水溶性的丹酚酸類和脂溶性的丹參酮類化合物,兩類成分又分別以丹酚酸B和丹參酮ⅡA為代表。近年來,丹酚酸類和丹參酮類化合物的制劑在臨床治療PF顯示出一定療效。但目前的關(guān)于丹參抗PF的研究,通常僅選擇丹酚酸類或者丹參酮類化合物中的一種成分來代表丹參進(jìn)行研究,且只對PF演變的某一個過程進(jìn)行研究,忽略丹酚酸類和丹參酮類成分之間的相互作用和PF發(fā)病過程的復(fù)雜性。因此本研究基于肺纖維化的形成機(jī)制,選擇THP-1與MRC-5兩種細(xì)胞模型,以及其共培養(yǎng)模型,對丹參中兩類主要藥效成分的代表化合物丹酚酸B和丹參酮ⅡA的抗肺纖維化作用機(jī)制及其協(xié)同作用進(jìn)行研究,為丹參類制劑的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供一定指導(dǎo),也為其治療PF提供理論依據(jù)。方法:(1)選用佛波酯(PMA)聯(lián)合脂多糖(LPS),以細(xì)胞貼壁情況和細(xì)胞分泌的IL-1β含量為指標(biāo)建立THP-1巨噬細(xì)胞炎癥模型;采用實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表達(dá)量和蛋白分泌量,研究丹酚酸B與丹參酮ⅡA磺酸鈉對炎癥的影響。(2)選用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1),以細(xì)胞增殖為指標(biāo),建立MRC-5肺纖維化模型;采用CCK-8法檢測丹酚酸B與丹參酮ⅡA磺酸鈉對TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞增殖的影響;采用免疫熒光法定性檢測α-SMA蛋白;采用qRT-PCR法和western blot法檢測α-SMA、纖維連接蛋白(FN)和Ⅰ型膠原α1(COL1α1)mRNA和蛋白的相對的表達(dá)量,研究丹酚酸B與丹參酮ⅡA磺酸鈉對肺纖維化的影響。(3)利用Transwell小室將兩種細(xì)胞共同培養(yǎng),加入LPS刺激,以細(xì)胞形態(tài)變化為依據(jù),初步建立THP-1巨噬細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞的共培養(yǎng)模型,采用qRT-PCR法檢測MRC-5細(xì)胞α-SMA的mRNA相對表達(dá)量,揭示丹參兩類成分對于PF多途徑作用的機(jī)制。結(jié)果:(1)丹酚酸B與丹參酮ⅡA磺酸鈉對THP-1巨噬細(xì)胞炎癥模型影響的結(jié)果表明:100 ng/mL的PMA作用THP-1細(xì)胞48 h,可以誘導(dǎo)其從懸浮細(xì)胞變?yōu)橘N壁的THP-1巨噬細(xì)胞。靜息24 h后,再聯(lián)合0.5μg/mL的LPS作用24 h可以建立高表達(dá)IL-1β的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥模型。ELISA和qRT-PCR結(jié)果表明:丹酚酸B和丹參酮ⅡA磺酸鈉不僅能從mRNA水平降低炎癥模型IL-1β和TNF-α的相對表達(dá)量(P0.05),還能從蛋白水平降低炎癥模型細(xì)胞分泌的IL-1β和TNF-α蛋白量。并從合用組的數(shù)據(jù)可以初步推測,兩類成分在抗炎方面可能不具有協(xié)同作用。(2)丹酚酸B與丹參酮ⅡA磺酸鈉對MRC-5肺纖維化細(xì)胞模型影響的結(jié)果表明:10 ng/mL的TGF-β1作用48 h可使MRC-5增殖加快(P0.05),且上調(diào)肺纖維化標(biāo)志物α-SMA、FN和COL1α1蛋白與mRNA水平,可建立MRC-5肺纖維化模型。免疫熒光結(jié)果顯示:α-SMA蛋白在各組細(xì)胞中均有表達(dá),且在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:合用組能顯著降低α-SMA蛋白的相對表達(dá)量(P0.05),而單獨(dú)用藥組不能;除丹酚酸B組外,陽性藥組、丹參酮ⅡA磺酸鈉組和合用組能顯著減低COL1α1蛋白的相對表達(dá)量(P0.05);除單獨(dú)用藥組外,陽性藥組和合用組也能顯著降低FN蛋白的相對表達(dá)量(P0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示:丹參的兩類主要成分和作為TGF-β1抑制劑的SB431542都可以顯著模型組降低α-SMA、FN和COL1α1的mRNA相對表達(dá)量(P0.05)。并從合用組的數(shù)據(jù)可以初步推測,兩類成分在抗肺纖維化方面可能具有協(xié)同作用。(3)丹酚酸B與丹參酮ⅡA對共培養(yǎng)肺纖維化模型影響的結(jié)果表明:先用100 ng/mL的PMA作用于THP-1細(xì)胞48 h得到THP-1巨噬細(xì)胞,再用Transwell小室將THP-1巨噬細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞共同適應(yīng)性培養(yǎng)24 h,之后加入0.5μg/mL的LPS誘導(dǎo)48 h,MRC-5細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化,提示MRC-5細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化。qRT-PCR結(jié)果顯示:地塞米松組、丹酚酸B組、丹參酮ⅡA磺酸鈉組和二者合用組的MRC-5細(xì)胞α-SMA相對mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.05)。提示丹酚酸B和丹參酮ⅡA磺酸鈉對于肺纖維化有較好的抑制作用,且抑制炎癥能一定程度上抑制肺纖維化進(jìn)程。結(jié)論:丹酚酸B、丹參酮ⅡA磺酸鈉以及二者合用對于M1經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞炎癥模型和TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5肺纖維化模型都有較好的抑制作用,具有抗炎和抗肺纖維化的活性,能通過多個途徑作用于PF,發(fā)揮治療作用。丹參的兩類主要成分丹酚酸B和丹參酮ⅡA在抗炎方面未見協(xié)同作用,但在抗纖維化方面體現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

丹參的主要活性成分主要分為兩大類,一類是水溶性成分,一類是脂溶性成分。至今發(fā)現(xiàn)的水溶性成分多達(dá)20余種,主要為酚酸類化合物,因此也被稱為丹參多酚酸。其中以丹酚酸B藥理活性最強(qiáng),是丹參水溶性成分的代表[39]。除了丹酚酸B,丹參水溶性成分中活性較強(qiáng)的還有丹參素、丹參酚酸A和迷迭香酸等成分[40]。大部分丹參多酚酸的基本結(jié)構(gòu)單元是丹參素,又名D(+)-β-(3,4-二羥基苯基)乳酸,是最早發(fā)現(xiàn)的水溶性成分[41]。丹酚酸B由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成[42],CAS號為115939-25-8,分子式為C36H30O16,分子量為718.6138,具體結(jié)構(gòu)式見圖1。目前發(fā)現(xiàn)的脂溶性成分多達(dá)50余種,多為二萜醌類化合物,其中以丹參酮類化合物含量最高[43]。丹參酮ⅡA作為丹參脂溶性成分中含量最多的單體成分,是丹參脂溶性成分的代表。除此以外,丹參的脂溶性活性成分還包括丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮Ⅰ等。丹參酮ⅡA,CAS號為568-72-9,分子式為C19H20O3,分子量296.3603,具體結(jié)構(gòu)式見圖2。圖2 丹參酮ⅡA化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖1 丹酚酸B化學(xué)結(jié)構(gòu)式兩類成分在體內(nèi)的代謝反應(yīng)不盡相同。水溶性成分主要發(fā)生甲基化和葡萄糖醛酸化等Ⅱ相代謝反應(yīng)。脂溶性成分,則主要發(fā)生脫氫,羥基化、呋喃環(huán)裂解和氧化等Ⅰ相代謝反應(yīng)[44]。因此,在應(yīng)用丹參治療疾病時,應(yīng)綜合考慮丹參兩類成分的功效和代謝特點(diǎn),發(fā)揮其最大的優(yōu)勢。

Transwell小室構(gòu)造
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