目的:觀察雷公藤甲素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT樣表型的影響,并探討引起EMT表型改變的可能機(jī)制。方法:雷公藤甲素作用于U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,CCK-8法檢測(cè)TP對(duì)兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC_(50),及IC_(50)濃度下細(xì)胞的增殖能力受到抑制的情況。細(xì)胞的遷移能力通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè),細(xì)胞的侵襲能力則通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。Western Blot分析TP作用于細(xì)胞后,上皮間質(zhì)化(EMT)標(biāo)志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、Slug等蛋白表達(dá)水平,同時(shí)檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B、Beclin-1、Atg-7。轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-LC3B質(zhì)粒進(jìn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TP對(duì)細(xì)胞自噬的影響。裸鼠皮下瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TP在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制情況,免疫組化檢測(cè)腫瘤組織EMT標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果:U87、U251細(xì)胞在雷公藤甲素的作用下,其增殖活力受到明顯的抑制,而且這種抑制效應(yīng)呈現(xiàn)出隨著劑量、時(shí)間的增加而增加的趨勢(shì)。U87細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC_(50)為20ng/ml,而U251細(xì)胞的IC_(50)為50ng/ml。雷公藤甲素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251細(xì)胞的遷移、侵襲能力有明顯的抑制作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)表明TP在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)了EMT的過程,即以E-Cadherin為代表的上皮標(biāo)志物出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),而以N-Cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、Slug等為代表的間質(zhì)標(biāo)志物則出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。雷公藤甲素引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬增強(qiáng),LC3B II/I比值升高,Beclin-1、Atg-7表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞免疫熒光顯示TP作用于細(xì)胞后自噬小體數(shù)量明顯增多。裸鼠皮下瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證了TP對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。免疫組化證實(shí)TP作用后腫瘤組織EMT標(biāo)志物E-Cadherin出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物,如N-Cadherin、Vimentin則出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:雷公藤甲素能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,并逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)化(EMT)進(jìn)程,而引起EMT逆轉(zhuǎn)的可能機(jī)制為雷公藤甲素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬增強(qiáng):由自噬介導(dǎo)通過ZEB1、Snail等通路改變E-cadherin和Vimentin表達(dá),從而抑制EMT進(jìn)程。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

第 3 章 結(jié)果第 3 章 結(jié)果3.1 計(jì)算半數(shù)抑制濃度 IC50不同濃度的 TP（1、5、10、20、50、100、200、400ng/ml）對(duì) U87、U251這兩種細(xì)胞系的細(xì)胞處理 48h，采用 CCK-8 法檢測(cè) OD 值，將所得的 OD 值轉(zhuǎn)換為與 TP 0ng/ml 組相比的細(xì)胞增殖活力百分比，通過 SPSS 軟件計(jì)算出兩種細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度IC50，其中U87的IC50為20ng/ml，而U251的IC50為50ng/ml（如圖 3-1 所示）。

圖 3-2 CCK8 檢測(cè) TP 作用 7 天 U87、U251 細(xì)胞增殖活力的改變。A. U87 細(xì)胞在 20ng/ml TP作用下細(xì)胞增殖活力的變化；B. U251 細(xì)胞在 50ng/ml TP 作用下細(xì)胞增殖活力的變化。（*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC 組）3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) TP 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響U87 細(xì)胞選擇了 0h、12h、24h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞的遷移能力，發(fā)現(xiàn) TP能明顯抑制細(xì)胞遷移。U251 細(xì)胞的遷移較慢，所以延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間至 48h，結(jié)果在 48h 的觀測(cè)點(diǎn)，同樣發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，TP 能明顯抑制細(xì)胞的遷移（圖 3-3）。

2 CCK8 檢測(cè) TP 作用 7 天 U87、U251 細(xì)胞增殖活力的改變。A. U87 細(xì)胞在 20ng/下細(xì)胞增殖活力的變化；B. U251 細(xì)胞在 50ng/ml TP 作用下細(xì)胞增殖活力的變化＜0.05，**P＜0.01 vs NC 組）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) TP 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響U87 細(xì)胞選擇了 0h、12h、24h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞的遷移能力，發(fā)現(xiàn)顯抑制細(xì)胞遷移。U251 細(xì)胞的遷移較慢，所以延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間至 48h，8h 的觀測(cè)點(diǎn)，同樣發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，TP 能明顯抑制細(xì)胞的遷移（圖
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