慢性心力衰竭是大多心臟性疾病終末期,臨床上多以改善患者生活質(zhì)量為治療目的。目前臨床上治療慢性心力衰竭多以西藥治療為主,但是存在不良反應(yīng)且只能改變生活質(zhì)量不能根治。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)整合作用的特點(diǎn),且副作用少。真武湯作為中藥復(fù)方的代表,臨床用藥經(jīng)驗(yàn)表明真武湯對(duì)慢性心力衰竭有顯著療效。中藥對(duì)不同狀態(tài)個(gè)體大多具有雙向調(diào)節(jié)作用,中藥對(duì)正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)所發(fā)揮的作用和功能可能是不同的,因此對(duì)于P450酶的表達(dá)和活性的調(diào)控也可能完全不同。鑒于真武湯在臨床治療慢性心衰時(shí)常常需要聯(lián)合用藥,因此研究真武湯對(duì)正常大鼠和慢性心衰疾病狀態(tài)的大鼠P450酶活性的影響具有重要的臨床意義。目的:本研究探討真武湯對(duì)正常狀態(tài)和慢性心力衰竭(Chonic heart failure,CHF)疾病狀態(tài)大鼠體內(nèi)7種肝細(xì)胞色素P450(CYP450)亞型酶活性和m RNA表達(dá)的影響,為慢性心力衰竭患者臨床合理用藥提供一定的理論指導(dǎo),并為真武湯的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。方法:(1)建立UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)7種CYP450酶(CYP1A2、CYP2B1、CYP2C6、CYP2C7、CYP2C11、CYP2D2、CYP3A1)對(duì)應(yīng)探針底物(非那西丁、安非他酮、雙氯芬酸、阿莫地喹、奧美拉唑、右美沙芬、咪達(dá)唑侖)的生物樣品分析方法。(2)54只雄性SD大鼠分為正常狀態(tài)大鼠(n=24)和慢性心力衰竭狀態(tài)大鼠(n=30),正常狀態(tài)大鼠均分為4組:生理鹽水組、真武湯低、中、高劑量(2.1875,4.375,8.75g/kg)組;與此同時(shí),通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制CHF模型,并均分為5組:假手術(shù)組、模型組、真武湯低、中、高劑量(2.1875,4.375,8.75g/kg)組。所有大鼠均連續(xù)灌胃4周,并于最后一天灌胃后尾靜脈注射7種探針?biāo)幬锘旌衔?在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)眼眥取血,經(jīng)UPLC-MS/MS測(cè)定各組大鼠血漿中7種探針底物的濃度,通過(guò)DAS 2.0及SPSS 23.0軟件處理探針底物的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),以此評(píng)價(jià)真武湯對(duì)各組大鼠CYP450s酶活性的影響;此外,檢測(cè)真武湯對(duì)CHF大鼠血流動(dòng)力學(xué)主要參數(shù),通過(guò)相關(guān)性分析藥代動(dòng)力學(xué)主要參數(shù)-血流動(dòng)力學(xué)主要參數(shù)及其變化的相關(guān)系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)CYP450s酶活性和慢性心力衰竭之間的關(guān)系。(3)與此同時(shí),27只相同批次的SD大鼠分為正常狀態(tài)(n=12)和疾病狀態(tài)(n=15),造模和分組方法與上述酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)相同,同樣地,在連續(xù)灌胃4周后,采用RT-q PCR技術(shù)測(cè)定各組大鼠肝臟中7種CYP450亞型酶m RNA表達(dá)。結(jié)果:(1)所建立的UPLC-MS/MS分析方法能夠同時(shí)測(cè)定大鼠血漿樣品7種探針底物非那西丁、安非他酮、雙氯芬酸、阿莫地喹、奧美拉唑、右美沙芬、咪達(dá)唑侖。(2)在正常狀態(tài)大鼠中,真武湯可以誘導(dǎo)CYP2C6、CYP2C11、CYP3A1酶活性,對(duì)CYP1A2、CYP2B1、CYP2C7、CYP2D2酶活性無(wú)影響;CHF疾病狀態(tài)下,大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C6、CYP2C11、CYP3A1活性顯著性降低,低、中、高劑量的真武湯可以不同程度逆轉(zhuǎn)CHF疾病狀態(tài)下各CYP450亞型酶活性變化,與此同時(shí),非那西丁、雙氯酚酸、奧美拉唑和咪達(dá)唑侖AUC及其變化與LVEDP呈現(xiàn)顯著性正相關(guān)(P0.05)。(3)在正常狀態(tài)大鼠中,真武湯給藥組可以不同程度上調(diào)CYP2C6、CYP2C11、CYP3A1 m RNA表達(dá)水平,對(duì)CYP1A2、CYP2B1、CYP2C7、CYP2D2 m RNA表達(dá)水平無(wú)影響;CHF疾病狀態(tài)下,大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2C6、CYP2C11、CYP3A1 m RNA表達(dá)水平顯著性降低,而CYP2C7、CYP2D2 m RNA表達(dá)無(wú)顯著變化,灌胃真武湯后,CYP1A2、CYP2C6、CYP2C11和CYP3A1 m RNA的表達(dá)量得到不同程度的逆轉(zhuǎn)。CYP1A2、CYP2C6、CYP2C11和CYP3A1 m RNA表達(dá)與血流動(dòng)力學(xué)主要參數(shù)LVEDP呈現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)(P0.05)。結(jié)論:CHF疾病狀態(tài)可以改變大鼠體內(nèi)5種CYP450酶活性和m RNA的表達(dá),真武湯可以相應(yīng)地逆轉(zhuǎn)其中4種CYP450酶的變化,使得CYP450酶趨向正常,同時(shí)通過(guò)相關(guān)性分析得出酶活性與血流動(dòng)力學(xué)之間存在一定的相關(guān)性,以此改善慢性心力衰竭病理狀態(tài)。提示CYP450酶變化在慢性心衰發(fā)生發(fā)展中具有參考意義,在慢性心力衰竭治療時(shí),應(yīng)充分考慮這種由代謝酶所介導(dǎo)的潛在藥物-藥物相互作用,本研究為臨床合理安全用藥及真武湯進(jìn)一步開發(fā)提供了理論指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1-1 探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo) UPLC-MS/MS 色譜圖 空白血漿色譜圖；B 探針底物及內(nèi)標(biāo)溶液色譜圖；C 空白血漿加探針底物及內(nèi)標(biāo)溶液色；D 大鼠尾靜脈注射探針底物后探針底物及內(nèi)標(biāo)色譜圖。（1.非那西丁、2.安非他酮、3.雙芬酸、4. 阿莫地喹、5. 奧美拉唑、6.右美沙芬、7.咪達(dá)唑侖、8.格列本脲）Fig 3-1 UPLC-MS/MS chromatograms of probes and the internal standard in SD rats plasma.(1.phenacetin; 2.bupropion; 3.diclofenac; 4. amodiaquine; 5. omeprazole; 6.dextromethorphan7.midazolam; 8.glibenclamide. )14

LC-4016 型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；XW-80A 微型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；-80℃/-20℃冰箱（日本 Sanyo/合肥美菱公司）。1.2 材料與試劑格列苯脲（純度≧98%，批號(hào)：10238-21-8）：上海源葉生物科技有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈：瑞典 OCEANPAK 公司；肝素鈉注射液：上海信可有限公司。1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同第一章“1.3”2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果真武湯對(duì)慢性心力衰竭狀態(tài)下大鼠 CYP450 酶活性影響實(shí)驗(yàn)方案，見圖 2-1。

圖 2-2 正常狀態(tài)大鼠體內(nèi)非那西丁的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（ng/mL）Fig 2-2 The mean concentration-time curve of phenacetin in normal rat plasma (ng/mL)
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