研究背景乳腺癌是成年女性最常見的惡性腫瘤,情志障礙往往伴隨乳腺癌始終,表現為心情抑郁、焦慮易怒、睡眠障礙、乏力懶言、強烈負罪感等,嚴重影響患者的身心健康、人際關系、生活質量和腫瘤治療效果。目前乳腺癌抑郁障礙尚無統(tǒng)一規(guī)范的診療指南,臨床多參考抑郁癥的診治,以口服西藥的方式為主。但由于西藥副作用較大,一些藥物有可能增加乳腺癌復發(fā)轉移的風險,加之患者抵觸情緒較重、依從性不佳,臨床療效往往不穩(wěn)定。中醫(yī)藥自古以來就重視情志因素在疾病中的作用,擅長在整體觀念的指導下,辨病與辨證相統(tǒng)一,具有安全性高、副作用小的特點,患者接受程度高,臨床效果明顯,在乳腺癌防治過程中發(fā)揮重要作用。炎性細胞因子是抑郁障礙形成的關鍵角色,炎性微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要物質基礎,髓系來源的抑制性細胞(MDSC)是惡性腫瘤炎癥微環(huán)境中大量存在的抑制性細胞,對機體的抗腫瘤細胞免疫應答具有很強的抑制效應。細胞焦亡是細胞程序性死亡方式中的一種,對腫瘤的調控發(fā)揮著兩面性作用:作為宿主有效防御機制,當腫瘤細胞胞內容物破裂排出到間質中時,可調動機體免疫應答消滅腫瘤細胞炎癥因子,但是若腫瘤細胞焦亡不受控制而無限制擴大,在腫瘤微環(huán)境中誘發(fā)炎癥瀑布反應,則會加劇腫瘤進展。焦亡過程中釋放的損傷相關分子模式(DAMPs)可使MDSC大量擴增,釋放的IL-1β等細胞因子是MDSC的重要活化因子。由此可見,細胞焦亡—MDSC—細胞因子可能是乳腺癌抑郁障礙的重要機制。調控細胞焦亡,抑制MDSC產生、使其失活或促進其分化成熟,是腫瘤抑郁的潛在治療靶點。疏肝解郁是中醫(yī)治療郁證的常用治法,疏肝健脾方是中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院腫瘤科治療乳腺癌的經驗方,在腫瘤科疏肝健脾法為主治療腫瘤的基礎上,結合經典名方逍遙散凝練而成,主要藥物包括柴胡、杭白芍、郁金、八月札、夏枯草、生黃芪、三七、甘草等,臨床應用具有較好的效果。課題組前期基礎研究顯示疏肝健脾方或合并吉西他濱化療治療抑郁障礙型乳腺癌小鼠,可抑制MDSC和NKT增殖,減緩CD8+T細胞早期凋亡,上調CD4+/CD8+比值,下調IL-4、IL-6、IL-13、TGF-β和IFN-γ等因子,可改善抑郁荷瘤小鼠生活質量、延長生存期。因而,我們提出疏肝健脾方可能通過調控細胞焦亡通路,干預炎癥因子的大量釋放,限制MDSC的擴增和活化,從而改善乳腺癌抑郁障礙。研究目的通過建立病證結合的抑郁障礙型乳腺癌小鼠模型,觀察疏肝健脾方對抑郁荷瘤小鼠的干預作用,探索疏肝健脾方作用于細胞焦亡調控MDSC的關鍵環(huán)節(jié)。研究方法基礎實驗研究分為三個部分:一、建立并評價小鼠抑郁荷瘤模型;二、觀察疏肝健脾方對抑郁荷瘤小鼠的干預作用;三、基于細胞焦亡,探索疏肝健脾方治療抑郁障礙型乳腺癌的作用機制。分述如下:一、建立并評價小鼠抑郁荷瘤模型1、將84只雌性BALB/c小鼠右側第二乳墊下接種2×105個4T1-luc細胞,24小時后隨機分成7組:化療組、中藥組、中西醫(yī)結合組(化療+中藥組)、抑郁荷瘤對照組、單純荷瘤對照組、單純抑郁對照組和正常對照組,每組12只,平均分為2籠,按照如下造模給藥方式飼養(yǎng)于廣安門醫(yī)院實驗動物中心:(1)吉西他濱化療組(GEM):接種腫瘤細胞且進行慢性溫和不可預知性應激抑郁造模。按照120mg/kg的吉西他濱(健擇)對小鼠行化學治療,即分別于接種細胞后的第1、7日,用0.9%氯化鈉注射液將健擇配成濃度為12mg/mL的溶液后1小時內進行腹腔注射,共2次。(2)疏肝健脾中藥組(SGJP):接種腫瘤細胞且進行慢性溫和不可預知性應激抑郁造模。疏肝健脾方(人用量:北柴胡10g、杭白芍15g、廣郁金12g、八月札15 g、夏枯草15 g、生黃芪30 g、三七粉5 g、甘草6 g,每日一劑),根據前期實驗基礎,采用每公斤體重小鼠用藥量相當于成人(60kg計)臨床用量15倍的用藥量。自接種次日給予小鼠疏肝健脾方灌胃,共28天。(3)中西醫(yī)結合組(GEM+SGJP,簡寫為:G+S):接種腫瘤細胞且進行慢性溫和不可預知性應激抑郁造模。該組動物即如(1)化療2次,同時如(2)每日中藥灌胃治療28天。(4)抑郁荷瘤對照組(DT):接種腫瘤細胞且進行慢性溫和不可預知性應激抑郁造模。實驗期間,在動物倫理允許范圍內,無任何治療措施。(5)單純荷瘤對照組(PT):只接種腫瘤細胞,不進行慢性溫和不可預知性應激抑郁造模。實驗期間,按照實驗動物中心規(guī)范,正常飼養(yǎng),自由攝食。在動物倫理允許范圍內,無任何治療措施。(6)單純抑郁對照組(PD):不接種腫瘤細胞,只進行慢性溫和不可預知性應激抑郁造模。無任何治療措施。(7)正常對照組(NC):不接種腫瘤細胞,不進行慢性溫和不可預知性應激抑郁造模。按照實驗動物中心規(guī)范,正常飼養(yǎng),自由攝食。2、通過蔗糖水試驗、曠場試驗和小鼠大腦海馬5-HT1AR的測定,判斷抑郁障礙模型成功情況。二、觀察疏肝健脾方對抑郁荷瘤小鼠的干預作用1、監(jiān)測小鼠體重變化,觀察腫瘤生長情況、測量瘤徑變化,取材后稱量瘤重,計算抑瘤率。2、流式細胞術檢測小鼠脾臟MDSC及其分型含量。3、透射電鏡觀察疏肝健脾方對抑郁障礙型乳腺癌小鼠腫瘤細胞焦亡形態(tài)的改變。三、基于細胞焦亡,探索疏肝健脾方治療抑郁障礙型乳腺癌的作用機制。1、RT-PCR 檢測 MDSC 上游 microRNAs:miR-146a、miR-155、miR-21。2、高效液相懸浮芯片檢測小鼠血清細胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-17A、TNF-α 等。3、Western-blot檢測細胞焦亡通路NLRP3、Caspase-1、ASC等蛋白。研究結果1、建立并完善了 2×105個細胞的4T1-luc乳腺癌小鼠模型,接種動物均成模。2、曠場試驗顯示:動物活躍程度為:正常組單純抑郁組單純荷瘤組中西醫(yī)結合組中藥組抑郁荷瘤組化療組。單純抑郁組、單純荷瘤組與正常組比較沒有顯著差異(P0.05),抑郁荷瘤組與正常組比較有極顯著差異(P0.001)。中藥組與抑郁荷瘤組比較具有顯著差異(P0.05),中西醫(yī)結合組與抑郁荷瘤組比較具有極顯著差異(P0.001)。中藥組與化療組比較具有顯著差異,中西醫(yī)結合組與化療組比較具有顯著意義(P0.05)。3、大腦海馬5-HT1AR平均光密度表達情況:正常組中西醫(yī)結合組中藥組單純抑郁組單純荷瘤組化療組抑郁荷瘤組,說明慢性溫和不可預知性應激會造成5-HT1AR含量減少,單用化療不能起到改善作用,單用中藥效果優(yōu)于單用化療,中西醫(yī)結合則顯著改善優(yōu)于CUMS造成的5-HT1AR含量減少。4、荷瘤各組腫瘤體積呈現出隨荷瘤時間延長腫瘤逐漸增大的趨勢,在前8天各組腫瘤體積變化不大,各組間無明顯差異,比較后無統(tǒng)計意義(P0.05)。8天之后腫瘤體積呈現出如下趨勢:抑郁荷瘤組單純荷瘤組中藥組化療組中西醫(yī)結合組。20天之后,中西醫(yī)結合組腫瘤體積小于化療組。差異有統(tǒng)計意義(P0.05)。5、生物發(fā)光小動物活體成像觀察荷瘤動物體內光子數變化,呈現出與腫瘤體積變化基本相同的趨勢,即:抑郁荷瘤組單純荷瘤組中藥組化療組中西醫(yī)結合組(P0.05)。6、(1)MDSC總含量:抑郁荷瘤組單純荷瘤組中藥組化療組中西醫(yī)結合組單純抑郁組正常組;單純荷瘤組、抑郁荷瘤組與正常組相比均具有顯著差異(P0.001),化療組、中藥組與抑郁荷瘤組比較具有極顯著差異(P0.001)。(2)Ly6C+Ly6G-占MDSC比例:中西醫(yī)結合組單純抑郁組正常組中藥組化療組單純荷瘤組抑郁荷瘤組。單純抑郁組與正常組比較沒有統(tǒng)計意義(P0.05),單純荷瘤組、抑郁荷瘤組與正常組比較有極顯著差異(P0.001)。中西醫(yī)結合組與抑郁荷瘤組比較具有極顯著差異,化療組、中藥組與抑郁荷瘤組比較沒有統(tǒng)計意義(P0.05)。(3)Ly6G+Ly6C-占MDSC比例:抑郁荷瘤組單純荷瘤組中藥組化療組中西醫(yī)結合組正常組單純抑郁組。單純荷瘤組、抑郁荷瘤組與正常組比較具有極顯著差異(P0.001),單純抑郁組與抑郁荷瘤組比較沒有統(tǒng)計意義(P0.05)。7、透射電鏡顯示各組荷瘤小鼠腫瘤細胞均有不同程度的細胞核皺縮,細胞器空泡化,自噬內吞物等,總體病變程度排序如下:中西醫(yī)結合組(極輕度病變)中藥組(輕度病變)單純荷瘤組(中度病變)化療組(重度病變)抑郁荷瘤組(嚴重病變)。8、(1)小鼠腫瘤組織中miR-146a的表達情況:中藥組單純荷瘤組中西醫(yī)結合組化療組抑郁荷瘤組。抑郁荷瘤組與單純荷瘤組比較有顯著差異(尸0.01),中藥組與抑郁荷瘤組比較有極顯著差異(P0.001)。(2)小鼠腫瘤組織中miR-155的表達情況:抑郁荷瘤組與單純荷瘤組比具有極顯著差異(P0.001)�；熃M、中藥組與抑郁荷瘤組比較有差異,有統(tǒng)計學意義(P0.05),中西醫(yī)結合組與抑郁荷瘤組比較具有顯著差異(P0.01),化療組、中藥組、中西醫(yī)結合組三組之間沒有明顯差異(P0.05)。(3)小鼠腫瘤組織中miR-21的表達情況:抑郁荷瘤組與單純抑郁組比較具有極顯著差異(P0.001),化療組、中藥組、中西醫(yī)結合組與抑郁荷瘤組比較均有差異,有統(tǒng)計學意義(p0.05)。化療組、中藥組、中西醫(yī)結合組三組之間沒有明顯差異(P0.05)。9、小鼠血清細胞因子含量:(1)IL-1β:與抑郁荷瘤組比較,藥物干預后IL-1β的含量均不同程度降低,其中中藥組、化療組、中西醫(yī)結合組與其相比均有極顯著差異(P0.001)。(2)IL-18:與抑郁荷瘤組比較,化療組含量顯著升高(P0.001),中藥組含量升高具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)IL-6:與抑郁荷瘤組比較,藥物干預后IL-6的含量均一定程度降低,其中中西醫(yī)結合組降低最顯著(P0.001)。(4)IL-17A:與抑郁荷瘤組比較,化療組與中西醫(yī)結合組的IL-17A的含量均顯著升高(均P0.001)。(5)TNF-α:與抑郁荷瘤組比較,化療組與中西醫(yī)結合組的TNF-α的含量均顯著升高(P0.001)。10、小鼠腫瘤蛋白含量表達:(1)NLRP3:化療組、中西醫(yī)結合組與抑郁荷瘤組比較有極顯著差異(P0.001),中藥組與抑郁荷瘤組比差異不大,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)Caspase-1:中西醫(yī)結合組與抑郁荷瘤組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),其余各組均無差異(P0.05)。(3)ASC:中藥組與抑郁荷瘤組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),中西醫(yī)結合組與抑郁荷瘤組比較具有顯著差異(P0.01)。研究結論1、疏肝健脾方可明顯改善抑郁障礙型乳腺癌小鼠的抑郁狀態(tài),聯(lián)合化療可控制腫瘤生長、重塑MDSC功能、調控腫瘤炎癥微環(huán)境。2、疏肝健脾方通過調控細胞焦亡和炎癥因子表達,進而調控microRNA并降低荷瘤鼠脾臟MDSC的含量,逆轉腫瘤局部免疫抑制狀態(tài)。3、基于NLRP3炎癥小體的細胞焦亡通路可能是疏肝健脾方作用于抑郁障礙型乳腺癌的重要機制。
【學位單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5;R-332
【部分圖文】：

圖１小鼠慢性不可預知性溫和刺激模型時間流程圖??

圖２蔗糖水試驗??

圖３抑郁障礙造模后曠場試驗動物靜止時間、運動時間、運動距離??＃＃＃＃＃＃
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