由于海洋環(huán)境的特殊性,使得海洋中的微生物與其宿主生物在長期共同進(jìn)化過程中形成了特有的代謝途徑,產(chǎn)生了許多活性顯著的次級代謝產(chǎn)物參與自身防御。這些化學(xué)物質(zhì)可能的生態(tài)作用為活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供了重要線索,引起了天然產(chǎn)物領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注,開啟了對海洋微生物的研究。近年來,對海洋微生物次級代謝產(chǎn)物的研究已成為海洋藥物研究的熱點。本課題組主要從事海洋無脊椎動物及其共附生微生物的活性次級代謝產(chǎn)物研究,對我國東沙、西沙海域的海洋無脊椎動物(珊瑚、海綿)及其共附生微生物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究。作為本課題組從海洋微生物中尋找活性物質(zhì)工作的延續(xù),本研究對我國東沙來源的珊瑚中共附生微生物進(jìn)行分離純化,經(jīng)過化學(xué)篩選,選取三株化學(xué)成分豐富的珊瑚共附生真菌Alternaria sp.Strain DX-FOF7、Aspergillus flavipes以及Trametes hirsute,對其化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行考察,以期得到活性物質(zhì)。采用正、反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析以及制備高效液相等多種色譜分離手段,對以上3種真菌的發(fā)酵液進(jìn)行分離純化。采用核磁共振、高分辨質(zhì)譜、紅外等多種現(xiàn)代結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù),結(jié)合文獻(xiàn)檢索,對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定;采用多種體外活性篩選模型對化合物的生物活性進(jìn)行評價。從豆莢軟珊瑚屬珊瑚(Lobophytum sp.)共附生真菌Alternaria sp.Strain DX-FOF7發(fā)酵液中分離得到15個化合物:macrophorin A(A1),(1R,5R,6R)-5-hydroxyl-4-(hydroxymethyl)-1-(((1S,4a R,8a R)-5,5,8a-trimethyl-2-methylene-6-oxodecahydronaphthalen-1-yl)methyl)-7-oxabicyclo[4.1.0]hept-3-en-2-one(A2),methyl 2-hydroxy-3-(((3-hydroxyl-3-(2-((1S,4aR,6S,8aR)-6-hydroxy-5,5,8a-trimethyl-2-methylenedecahydronaphthalen-1-yl)acetyl)-5-oxocyclopent-1-en-1-yl)methyl)thio)propanoate(A3),butyrolactone I(A4),aspernolide A(A5),aspterric acid(A6),1-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-glycerol(A7),wasabidienone E(A8),(2S,5S,7S)-3a-hydroxyl-exogonic acid(A9),cephalosporolides E(A10),cephalosporolides F(A11),terrein(A12),penicillic acid(A13),territrems B(A14),(9R)-territrems B(A15)經(jīng)檢索,化合物A3和A15為新化合物,化合物A3鑒定為新骨架化合物,其余化合物均為首次從該株真菌中分離得到。從短足軟珊瑚屬珊瑚(Cladiella sp.)共附生真菌Aspergillus flavipes中分離得到7個化合物:trichalasin H(B1),aspergilluchalasin(B2),aspochalasin I(B3),aspochalasin D(B4),aspochalasin E(B5),aspochalasin K(B6),penilumamide(B7),化合物B7為肽類化合物。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn),化合物B7為首次從該株真菌中分離得到。從短足軟珊瑚屬珊瑚(Cladiella sp.)共附生真菌Trametes hirsute中分離得到9個化合物:3β-Hydroxy(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one(C1),ergosterol peroxide(C2),5α,6α-epoxy-(22E,24R)-ergosta-8,22-diene-3β,7β-diol(C3),3β-pregn-5-ene-20-one-3-ol(C4),proloquatifoligenin III(terpene glycoside)(C5),(3R,6E,10S)-2,6,10-trimethyl-3-hydroxydodeca-6,11-diene-2,10-diol(C6),cepharosporolide C(C7),Methyl 4-hydroxybenzoate(C8),N-Acetyltyramine(C9)。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn),本次研究為首次從該屬珊瑚中分離得到真菌Trametes hirsute,化合物C1-C9均為首次從該株真菌中分離得到。采用CCK-8法對化合物B1-B7,C1-C9進(jìn)行抗腫瘤活性測試,以目前臨床上發(fā)病率較高的人非小細(xì)胞肺癌(A549),前列腺癌(PC-3),肝癌(Bel-7404)和人髓性白血病細(xì)胞(K562)作為研究對象,對化合物抗腫瘤活性進(jìn)行初步篩選,結(jié)果顯示,化合物B1,B3,B4,B6,C2,C3顯示出一定的細(xì)胞毒活性,其余化合物IC_(50)值均在100μM以上。采用核因子κB受體活化因子配基(RANKL)誘導(dǎo)小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞(Bone marrow macrophagecells,BMMs)分化為成熟的破骨細(xì)胞,經(jīng)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)特異性染色,檢測化合物B1-B7,C1-C9對小鼠BMMs向破骨細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示,化合物B3和B4能顯著抑制BMMs向破骨細(xì)胞分化,化合物C1和C3能促進(jìn)BMMs向破骨細(xì)胞分化。采用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測化合物A1-A13,B1-B7對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)活性;采用APC-CD3、APC-CD4、APC-CD8抗體標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測,評價了以上化合物對T淋巴細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的影響。結(jié)果顯示以上化合物對小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖和分化未表現(xiàn)出明顯的生物活性。采用PD-1/PD-L1結(jié)合分析試劑盒,對化合物A1-A13,B1-B7對PD-1/PD-L1蛋白結(jié)合抑制活性進(jìn)行測試。結(jié)果顯示,部分受試化合物在100μM濃度下對PD-1/PD-L1蛋白結(jié)合顯示出一定的抑制活性。本研究從三株珊瑚共附生真菌中共分離并鑒定了31個化合物,包括2個新化合物,其中1個為新骨架化合物,24個化合物為首次從其各自真菌中分離得到,首次對真菌Trametes hirsute的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。采用多種活性評價模型對部分化合物進(jìn)行了活性測試,篩選得到4個具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化活性的化合物。以上研究對海洋天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型和數(shù)量進(jìn)行了擴充,對骨代謝疾病、以PD-1/PD-L1為靶點的免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤研究提供了一定參考,為課題組進(jìn)一步尋找活性先導(dǎo)化合物提供了一定化合物基礎(chǔ),為我國海洋資源的合理利用提供了研究資料。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

海軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文（四）結(jié)果與討論本實驗中采用核因子κB受體活化因子配基 (RANKL) 誘導(dǎo)小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞 (BMMs) 分化為成熟的破骨細(xì)胞，經(jīng)抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 特異性染色，考察受試化合物對小鼠單核巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的作用。結(jié)果顯示，化合物 B3 和 B4 能顯著抑制 BMMs 向破骨細(xì)胞分化，化合物 C1 和 C3 能促進(jìn)BMMs 向破骨細(xì)胞分化。表明這化合物 B3 和 B4 對新型抗骨質(zhì)疏松藥物的研究可能具有重要意義，化合物 B3 和B4 在結(jié)構(gòu)上都含有C-13, 14 和C-19, 20 雙鍵，推測活性的存在可能與這兩個位置的雙鍵有關(guān)。

圖1日2B3B4BS日6B7，00日M
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本文編號：2874564