目的:探討松子蛋白保護神經(jīng)元作用及機制。方法:(1)利用鹽析法提取松子蛋白,利用SDS-PAGE檢測松子蛋白的分子量范圍,利用全自動氨基酸分析儀分析松子蛋白氨基酸組成與含量;(2)體外實驗:利用過氧化氫(H_2O_2)建立SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷模型。分為空白對照組,模型對照組,松子蛋白低劑量給藥組、松子蛋白中劑量給藥組、松子蛋白高劑量給藥組通過MTT比色法檢測松子蛋白對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測松子蛋白對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響,利用Western blotting技術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1、Aβ_(1-42)蛋白的表達水平,利用RT-PCR技術(shù)檢測小鼠神經(jīng)細(xì)胞中中Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1基因的表達水平;(3)體內(nèi)實驗:選取ICR種小鼠,采用血管性癡呆模型小鼠,分為假手術(shù)對照組、模型對照組、陽性給藥組、松子蛋白低劑量給藥組、松子蛋白中劑量給藥組、松子蛋白高劑量給藥組,利用Morris水迷宮與跳臺實驗對小鼠進行行為學(xué)檢測,采用SOD、MDA、GSH生化試劑盒檢測松子蛋白對小鼠海馬抗氧化能力影響,HE染色觀察松子蛋白對小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響,TUNEL染色法檢測松子蛋白對小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響,采用Western blotting技術(shù)檢測小鼠腦組織中Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1、Aβ_(1-42)蛋白的表達水平。結(jié)果:(1)松子蛋白主要分布在3.3~14.4KDa和20.1~25KDa,松子蛋白含有7種必需氨基酸、10種非必需氨基酸;(2)松子蛋白能提高H_2O_2所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的存活率(P0.05),抑制SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(P0.05);(3)松子蛋白能減少血管性癡呆模型小鼠逃避潛伏期和逃避路程(P0.05),增加其腦組織中GSH和SOD的水平(P0.05),降低腦組織中MDA的含量(P0.05),松子蛋白能維持小鼠海馬神經(jīng)元的完整性和排列緊密度,抑制核固縮,減少小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡,體外與體內(nèi)實驗均證明松子蛋白可上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白的表達水平(P0.05),下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Aβ_(1-42)、Keap1和Bax蛋白的表達水平(P0.05)。結(jié)論:松子蛋白可能通過促進Nrf2信號通路的傳導(dǎo),上調(diào)Nrf2、HO-1、Bcl-2的表達水平,下調(diào)Aβ_(1-42)、Bax的表達水平,抑制氧化損傷和神經(jīng)元的凋亡,從而起到神經(jīng)元的保護作用。
【學(xué)位單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

Ada)Maker PEBMaker圖 1-1 SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖（A.Maker 10~180KDa B.Maker 3.3~31KDa）如圖 1-1（A 和 B）結(jié)果顯示：松子蛋白分子量在 3.3~55KDa 之間�？煞譃樗膫�區(qū)間部分：3.3~14.4KDa，20.1~25KDa，31~35KDa，40~55KDa；其中蛋白質(zhì)主要分布在 3.3~14.4KDa 和 20.1~25KDa。3.2 氨基酸分析結(jié)果表 1-1 松子蛋白氨基酸組成必需氨基酸 含量（%）Thr 2.023Val 2.422Met 1.748

提取總蛋白 6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞，按照 2.2 法進行分組給藥，胰酶消化后 PBS 洗 3 次細(xì)50μL/孔 RIPA 裂解液，冰浴裂解 45min，后將裂解液轉(zhuǎn)移至 EP 管中~14,000g，4℃離心 3~5min，離心后取上清液，保存于-80℃冰箱中備用測定總蛋白濃度用 Easy Protein Quantitative Kit 法進行蛋白濃度的測定，具體檢測方法熱酶標(biāo)儀 30min，并將考馬斯亮藍于室溫中靜止 20min 后，分別于 96入 0、1、5、7、9、10μL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.22mg/mL），且每孔水補至體積為 10μL，每孔加入 100μL 考馬斯亮藍染液并于搖床震搖，在 595nm 波長下，測定不同組別蛋白樣本的 OD 值，計算出蛋白標(biāo)準(zhǔn)y=0.883x-0.1705，R2=0.9946（y 軸為濃度 C，x 軸為 OD 值）。標(biāo)準(zhǔn)曲圖 2-1。

PEH圖 2-2 PE 對 H2O2造模 SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)的影響3.3 PE 對 H2O2致?lián)p傷的 SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響利用 AnnexinV-FITC 雙染法以檢測各組細(xì)胞凋亡率情況，如圖 4 顯示，Blank組 SH-SY5Y 細(xì)胞早期凋亡率為（31.8±0.06）%，晚期凋亡率為（1.0±0.09）%；模型組 SH-SY5Y 細(xì)胞早期凋亡率為（55.4±0.12）%，晚期凋亡率為（7.3±0.15）%；PEL 給藥組早期凋亡率為（44.4±0.02）%，晚期凋亡率為（1.6±0.09）%；PEM 給藥組早期凋亡率為（35.1±0.03）%，晚期凋亡率為（0.4±0.02）%；PEH給藥組早期凋亡率為（34.0±0.02）%，晚期凋亡率為（0.4±0.05）%。對總凋亡率進行分析，如表 5，Blank 組總凋亡率（32.8±0.13）%，模型組總凋亡率（62.7±0.32）%，PEL 給藥組總凋亡率（46.0±0.15）%，PEM 給藥組總凋亡率（35.5±0.03）%，PEH 給藥組總凋亡率（34.4±0.06）%；與 Blank 組比較，Model 組總凋亡率明顯增加（P<0.05），與模型組比較，PE 三個給藥組總凋亡率明顯降
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本文編號：2872164