炎癥是機體應對外界刺激做出的復雜防御反應,適度的炎癥反應對機體是有利的,而過度持久的炎癥反應會釋放大量的炎癥因子,直接或間接造成細胞和組織受損,誘發(fā)各種炎性相關疾病發(fā)生。目前,從天然資源中獲得新型抗炎藥物是開發(fā)抗炎藥物的重要途徑之一。本實驗室在前期“當歸芍藥散”藥效物質挖掘工作中分別從澤瀉和白芍中獲得了具有抗炎活性的澤瀉三萜成分和白芍單萜類化合物;同時在從動物放線菌中尋找活性物質過程中獲得了一類抗炎活性的新型大環(huán)內酰胺化合物。為了深入探究澤瀉三萜、白芍單萜和大環(huán)內酰胺類化合物的抗炎活性及機制,本論文分別以LPS/D-gal誘導小鼠和LPS誘導RAW 264.7細胞建立了體內外炎癥模型,采用共聚焦顯微成像、RT-qPCR、ELISA和Western blot等多種實驗技術手段,從炎癥因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達以及炎癥信號通路MAPK、NF-κB、JAK/STAT和PI3K/Akt的活化來探討各單體化合物的抗炎活性及其作用機制。為闡明當歸芍藥散發(fā)揮療效的分子機制,及新型抗炎藥物研發(fā)提供了實驗依據(jù)。主要研究包括以下三部分:一、利用LPS誘導RAW 264.7細胞炎癥模型和LPS/D-gal誘導急性肝炎小鼠模型,首次評價澤瀉三萜alisol F和25-anhydroalisol F抗炎活性及機制。結果表明 alisol F 和 25-anhydroalisol F 抑制 LPS 激活的 RAW 264.7 細胞釋放 NO、TNF-α、IL-1β和IL-6,且在3.3-100 μM濃度范圍內均無細胞毒性;另外,alisol F 和 25-anhydroalisol 不僅明顯抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和 COX-2 基因水平表達,還顯著下調iNOS和COX-2蛋白的表達。Western blot結果表明,alisol F 和 25-anhydroalisol F 降低磷酸化 MAPKs(p-ERK、p-JNK 和 p-p38)和 p-stat3 蛋白表達;同時,顯著抑制LPS引起的p-p65和p-IκB-α蛋白的表達,緩解IκB-α蛋白降解,從而抑制LPS引起的p65蛋白在細胞核中的表達,使得p65在胞漿中的表達增多。免疫熒光結果也表明,alisolF和25-anhydroalisolF能夠阻礙LPS引起的p65核移位。與體外結果一致,alisolF顯著抑制LPS/D-gal誘導的急性肝炎模型小鼠釋放TNF-α、IL-1β和IL-6,抑制肝炎小鼠血清中ALT和AST的酶活性。另外alisol F可抑制p-ERK和p-JNK蛋白的表達,緩解IκB-α蛋白的降解,HE染色結果表明alisol F可明顯緩解炎癥反應引起的肝損傷。推測alisol F和25-anhydroalisol F可能通過阻斷MAPK、JAK/STAT和NF-κB信號通路的激活,降低各炎癥介質的表達,從而起到抗炎作用。二、利用LPS誘導RAW 264.7細胞建立體外炎癥模型,首次考察九個白芍單萜的抗炎活性、構效關系及抗炎機制。結果表明九個單萜類化合物:paeonidanin(PD)、albiflorin(AF)、paeoniforin(PF)、4-O-methylpaeoniflorin(MPF)、benzoylalb-iflorin(BAF)、galloylalbiflorin(GAF)、debenzoylalbiflorin(DAF)、4-O-methylbe-nzoylpaeoniflorin(MBPF)和 paeonidanin A(PDA)可不同程度抑制 LPS 激活的RAW264.7細胞釋放NO、TNF-α和IL-6,由構效關系分析可知,白芍單萜抗炎活性與化合物的母核結構直接相關,具有paeoniflorin(PF、MPF和MBPF)和paeonidanins(PD和PDA)母核的單碎化合物的抗炎作用明顯強于albiflorin類衍生物(AF、BAF、GAF和DAF);另外,在albiflorin單萜母核中引入沒食子�；黠@增強其抗炎活性。因此,本研究選擇活性較好且量較多的MBPF探討該類單萜的抗炎機制。結果表明MBPF可顯著抑制LPS激活的RAW 264.7細胞iNOS基因和蛋白水平的表達;同時,MBPF明顯抑制p-ERK、p-JNK、p-p38、p-c-Jun、p-Akt、p-p65、p-IκB-α蛋白表達,阻止蛋白IκB-α降解,增加p65在胞漿中的表達,而降低p65在核中的表達。因此,推測MBPF可能通過阻斷炎癥信號通路MAPK、PI3K/Akt和NF-κB激活,而抑制炎癥因子表達。三、本研究利用LPS誘導RAW 264.7細胞建立體外炎癥模型,首次考察五個大環(huán)內酰胺類新型化合物抗炎活性及機制。結果表明五個大環(huán)內酰胺類化合物均能抑制LPS激活的細胞釋放NO,且無細胞毒性,排除抗炎活性由細胞毒作用引起。五個大環(huán)內酰胺類化合物均能夠顯著抑制LPS激活的巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達。選取活性較好且量較多的化合物497-1探討其作用機制,結果表明497-1不僅抑制iNOS和COX-2基因和蛋白水平的表達,還下調LPS引起的p-p65和p-IκB-α蛋白表達,阻礙IκB-α降解,阻止p65核移位,從而抑制NF-κB信號通路激活;此外,磷酸化MAPKs(p-ERK、p-JNK和p-38)和p-Akt蛋白表達明顯受到抑制。由此,推測497-1通過阻斷MAPK、PI3K/Akt和NF-κκB信號通路抑制炎癥因子表達。
【學位單位】：東北大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

２．２．９．１小鼠編號??一般給實驗小鼠編號按腳趾編號法進行編號，首先用左手抓住小鼠，使小鼠??腹部向上面，按圖２．２所示編號剪掉小鼠腳趾進行編號。小鼠的后肢１０個腳趾??依次表示１－１０，前肢８個腳趾代表２－９的十位數(shù)編號。??４〇＋?５０ｉ?６０＋?７０＋??３０＋?＼?／?＼?＼?Ｉ??Ｉ?＼??．５?／?＼?６?７?，??圖２．２小鼠腳趾編號方法??Ｆｉｇ．?２．２?Ｔｏｅｓ?ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ?ｍｅｔｈｏｄ?ｉｎ?ｍｉｃｅ??２．２．９．２?ＬＰＳ／Ｄ－ｇａｌ誘導小鼠急性肝炎模型??本實驗所用實驗動物為Ｃ５７ＢＬ／６成年雄鼠（６－８?ｗｅｅｋ），體重為２０－２５?ｇ，苺??天提供給老鼠充足的水分和食物，１－２天換一次墊料，持續(xù)喂養(yǎng)一周左右，即可??進行實驗。利用ＬＰＳ／Ｄ－ｇａｌ構建小鼠急性肝炎模型，結合相關文獻，確定ＬＰＳ和??Ｄ－ｇａｌ的用量和誘導時間，最終確定ＬＰＳ用量是４０呢／ｋｇ，Ｄ－ｇａｌ用量為７００?ｍｇ／ｋｇ，??化合物ａｌｉｓｏｌＦ用量為２０ｍｇ／ｋｇ，選用地塞米松作為陽性對照，用量為５ｍｇ／ｋｇ，??所有藥物都用４０％的１

幔睿瑁?洌潁錚幔歟椋螅錚歟瓶寡諄钚約盎?蒲芯浚崳?丑�。奕敕z測１＾８誘導的１＾＼￥?２６４．７細胞分泌１＾－〇［、１１＾叩和１１＾６，結??果如圖２．８所示。與空白對照組相比，ＬＰＳ刺激細胞１２?ｈ后，發(fā)現(xiàn)細胞釋放的??ＴＮＦ－ｏｕ?ＩＬ－ｌｐ和ＩＬ－６顯著增加；與ＬＰＳ模型組相比，陽性藥地塞米松（３３｜＿ｉＭ）??顯著抑制?ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｉｐ?和?ＩＬ－６?釋放，另外?ａｌｉｓｏｌＦ?和?２５－ａｎｈｙｄｒｏａｌｉｓｏｌＦ?也不同??程度抑制細胞分泌ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｌｐ和ＩＬ－６，且抑制作用隨著濃度的增加而逐漸增??強。??－３１?－??

圖２．９?Ａｌｉｓｏｌ?Ｆ和２５－ａｎｈｙｄｒｏａｌｉｓｏｌ?Ｆ對ＬＰＳ激活ＲＡＷ??
【參考文獻】

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本文編號：2872100