發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 07:39

　　 研究背景與目的肺纖維化是彌漫性間質(zhì)性肺疾病的簡(jiǎn)稱,以細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性沉積,肺組織結(jié)構(gòu)破壞,影像學(xué)下可見(jiàn)肺組織出現(xiàn)蜂窩狀改變,肺功能逐步喪失的病理過(guò)程為特點(diǎn)。以α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a smooth muscle actin,α-SMA)高表達(dá)為特征的肌成纖維細(xì)胞的形成是肺纖維化的核心環(huán)節(jié)。肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于原位成纖維細(xì)胞的激活轉(zhuǎn)化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)兩種途徑,因而阻斷肌成纖維細(xì)胞形成的途徑,有望為肺纖維化的治療帶來(lái)新策略。由于肺纖維化目前尚無(wú)完全有效的西醫(yī)治療藥物,傳統(tǒng)的抗炎、抗氧化、抗纖維化藥物均無(wú)法帶來(lái)實(shí)質(zhì)性臨床療效,靶向藥物的研究是目前肺纖維化治療的新方向,凸顯出肺纖維化機(jī)制研究的重要性。中醫(yī)藥對(duì)肺纖維化的防治有其獨(dú)特性,辨證論治以及辨病論治相結(jié)合的防治思路在臨床上收到良好療效,可減輕疾病帶來(lái)的痛苦、提高病人生活品質(zhì)、延長(zhǎng)生命周期等,然而中藥組方多變、成分復(fù)雜,阻礙了中醫(yī)藥治療肺纖維化的廣泛應(yīng)用。因此,精選臨床對(duì)本病確切有效、理論依據(jù)可靠的中藥復(fù)方為基點(diǎn)加以深入研究,具有重要理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。養(yǎng)肺活血方是臨床多年應(yīng)用的驗(yàn)方,具有良好的治療肺纖維作用,對(duì)其作用機(jī)制的探討既往已有較多成果。所以,本論文在教育部博士點(diǎn)基金研究基礎(chǔ)上,依托國(guó)家自然基金項(xiàng)目,主要圍繞肺成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞激活轉(zhuǎn)化以及中藥復(fù)方養(yǎng)肺活血方在表型轉(zhuǎn)化中的作用進(jìn)行研究。肺纖維化發(fā)病及致死率高,對(duì)其發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究歷來(lái)是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。有關(guān)肺纖維化的研究中西醫(yī)已有大量報(bào)道,新的進(jìn)展和成果令人矚目。因此,論文第一部分著手于文獻(xiàn)整理,分別對(duì)肺纖維化、肌成纖維細(xì)胞(MFB)表型轉(zhuǎn)化的西醫(yī)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,從分子、基因?qū)用嬖斒銎洳∫虿C(jī),為中藥干預(yù)的機(jī)制探討奠定基礎(chǔ)。此外,對(duì)中醫(yī)學(xué)對(duì)肺纖維化理法方藥的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,闡明中醫(yī)藥治療肺纖維化的理論基礎(chǔ)。有效方藥的機(jī)制探討是肺纖維化研究的核心環(huán)節(jié),故論文第二部分重點(diǎn)探討?zhàn)B肺活血方在肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的干預(yù)作用及調(diào)控機(jī)制。研究方法1、以全基因組甲基化測(cè)序及功能分析的方法,觀察模型組和養(yǎng)肺活血方組對(duì)其的影響。采用博來(lái)霉素(BLM)氣管一次性給藥復(fù)制大鼠肺纖維化動(dòng)物模型,正常組大鼠不造模處理。正常組和模型組大鼠生理鹽水灌胃14天、養(yǎng)肺活血方組按劑量灌胃養(yǎng)肺活血方濃縮液14天,14天后處死大鼠并取肺組織。HE染色、Masson染色、電鏡實(shí)驗(yàn)綜合反映大鼠肺纖維化造模是否成功,然后采用全基因組甲基化亞硫酸鹽法測(cè)序(WGBS)的方法對(duì)正常組、模型組、養(yǎng)肺活血方用藥組肺組織進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序及功能分析。2、在大鼠原代細(xì)胞肺纖維模型基礎(chǔ)上,觀察養(yǎng)肺活血方對(duì)肌成纖維細(xì)胞功能的影響。采用大鼠肺組織原代培養(yǎng)并純化得到肺成纖維細(xì)胞(FB),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)造模使肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞;同時(shí)制備養(yǎng)肺活血方兔含藥血清。以體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法,免疫熒光定性檢測(cè)αa-SMA熒光的表達(dá)位置及強(qiáng)度、Western Blot定量測(cè)定α-SMA蛋白表達(dá)、膠原收縮直觀反映肌成纖維細(xì)胞收縮能力的改變。3、以體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法,從Notch信號(hào)通路研究養(yǎng)肺活血方對(duì)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。采用Western Blot檢測(cè)Notch受體、配體及下游效應(yīng)基因的改變、采用免疫共沉淀方法反映Notch胞內(nèi)段(NICD1)與核內(nèi)效應(yīng)蛋白CSL結(jié)合情況、采用慢病毒轉(zhuǎn)染Notchl目的基因至成纖維細(xì)胞并檢測(cè)養(yǎng)肺活血方不同劑量用藥后細(xì)胞內(nèi)COL-I的表達(dá)。4、以液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)養(yǎng)肺活血方主要成分。按養(yǎng)肺活血復(fù)方劑量比例稱取中藥材,醇提得到復(fù)方總成分,采用液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)養(yǎng)肺活血方進(jìn)行成分檢測(cè)分析。研究結(jié)果1、對(duì)不同染色體進(jìn)行甲基化水平分析,可以看出不同樣本不同染色體甲基化水平存在差異,空白、模型、養(yǎng)肺活血方三組CG區(qū)域甲基化差異不大,主要差異性基因在CHG、CHH。對(duì)不同樣本基因組不同功能區(qū)域的甲基化信息進(jìn)行聚類分析,可以很清晰看出空白、模型、養(yǎng)肺活血方三個(gè)組甲基化狀態(tài)存在差異,同時(shí)養(yǎng)肺活血方與空白組有更多相似性,說(shuō)明養(yǎng)肺活血方具有調(diào)控DNA甲基化的作用。2、采用TGF-β1(5ng/mL)處理成纖維細(xì)胞24小時(shí)能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為免疫組化α-SMA 陽(yáng)性表達(dá),且TGF-β1處理組細(xì)胞纖維絲明顯。養(yǎng)肺活血方含藥血清作用后,可以明顯抑制成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,α-SMA、COL-I、COL-III表達(dá)降低,且膠原收縮受到抑制。3、養(yǎng)肺活血方含藥血清無(wú)論高、中、低劑量均可降低Notch受體Notchl、Notch3,配體Jaggedl、DLL4,下游效應(yīng)蛋白CSL表達(dá);免疫共沉淀說(shuō)明含藥血清可以降低Notchl胞內(nèi)段NICD1入核與CSL結(jié)合,阻斷下游產(chǎn)物的生成;轉(zhuǎn)染Notchl病毒的成纖維細(xì)胞COL-I含量升高,養(yǎng)肺活血方含藥血清作用后成纖維細(xì)胞COL-I表達(dá)明顯降低。4、中藥復(fù)方含有單味藥有效成分,實(shí)驗(yàn)與7個(gè)標(biāo)品對(duì)照,共檢測(cè)到兒茶素、阿魏酸、白藜蘆醇苷、毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、丹酚酸B、五味子乙素和異歐前胡素等成分。研究結(jié)論1、養(yǎng)肺活血方能夠調(diào)控DNA甲基化。2、養(yǎng)肺活血方含藥血清能夠抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的活化;養(yǎng)肺活血方含藥血清能夠抑制Notch信號(hào)通路的活化,對(duì)成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)控。主要?jiǎng)?chuàng)新之處1、采用高通量全基因組甲基化測(cè)序及功能分析的方法,從基因?qū)哟翁接懥损B(yǎng)肺活血方對(duì)肺纖維化基因甲基化的干預(yù)作用,為后續(xù)更深入的研究奠定了良好基礎(chǔ)。2、以Notch信號(hào)通路為著眼點(diǎn),在大鼠原代細(xì)胞肺纖維化模型基礎(chǔ)上,從影響肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的角度,深入揭示了養(yǎng)肺活血方多靶點(diǎn)效應(yīng)的主要作用機(jī)制。3、采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),首次對(duì)臨床驗(yàn)方養(yǎng)肺活血方進(jìn)行了成分分析,明確了該方的主要有效成分,為肺纖維化的臨床中藥研究提供了可靠依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ?Ｇｏｌｄ?Ｋｉｔ，?Ｚｙｍｏ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ），經(jīng)過(guò)處理，未發(fā)生甲基化的Ｃ變成Ｕ（ＰＣＲ擴(kuò)增后??變?yōu)椋裕�，而甲基化的Ｃ保持不變，最后進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，得到最終的ＤＮＡ文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建??流程圖如下（圖１．１）：??ｍｅ?ｎｅ??Ｉ?Ｉ??？？ＧＣＧＧＣＡＴＧＩＴＴ?ＡＡＡＣＧＧ?Ｗ??３…＂ＧＧＧＧＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＧ＾？？…．５??Ｆｒａｙｎｅｎｔａｔｌｏｎ??Ｉ?Ｊ?ｉ??ＵＣＧＧＣＡ了?ＧＴＴＴＡＭＣＧＣＴ？？…？玄??３－？．．？ＧＧＣＣＧ?ｔＡＣ?ａａａｔｔｔ?ｇｃ?ＧＡ?５??Ｆｉｌｌ?ｉｎ?＆?ａｄｄ?Ａ??ｍｅ?＼ｊ?ｍ＆??＾？？？？？？ＣＣ?ＧＧＣＡＴＧ?Ｔ?Ｔ?ＴＡ／ＶＣＧＣ?Ｔ??Ａ＾ＧＧＣＣＧ丁?ＡＣＡＭＴＴＴＣＸＧＡ—ｓ??Ａｄａｐｔｏｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ??ｍｅ?ｉｊ?ｒｎｅ??５？．．．．ＣＣ６ＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＴ．．，－＾３?—??３Ａ．？．，．Ｇａ：ＣＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＯ：Ｇ４ｓ??Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ??Ｖ??ｍｅ?ｒｒ＜ｅ??ｆ？￣?Ｉ?１?ｆｓＴ??ｗｍｍｍｍｍｍｍ?：Ｔ．ＵＵＧＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＵＴ．．－．＾Ｊ????■??ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??＜）＾——．．．．?—??ｓＴ？．．．．ＴＴＧＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＴ．．．＿．ｓ?ｉ?舊―獨(dú)??，Ａ＿．．．ＡＡＣＣＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＡＡ．．．．．．Ｓ??圖１．?１文庫(kù)構(gòu)建流程圖??Ｃ．

向互補(bǔ)）的轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的測(cè)序結(jié)果和基因組分別進(jìn)行兩兩比對(duì)，將所有的比對(duì)結(jié)果輸??出。??Ｂｉｓｍａｒｋ比對(duì)的基本思路如下圖１．３所示：??⑴將基因組序列和測(cè)序ｒｅａｄ分別作Ｃ－ｔｏ－Ｔ和Ｇ－ｔｏ－Ａ轉(zhuǎn)換；??（２）

析過(guò)程中設(shè)定了一組閾值（ＥｈｓａｎＨａｂｉｂｉｅｔａｌ．，２０１３，ＣａｓｅｙＡ．Ｇｉｆｆｏｒｄｅｔａｌ．，２０１３?），以便找??到準(zhǔn)確的甲基化位點(diǎn)：（１）測(cè)序深度大于等于５；?（２）?ｑ－ｖａｌｕｅ小于等于０．０５。??Ｂｉｓｍａｒｋ甲基化檢測(cè)的基本思路如下
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本文編號(hào)：2869827