目的:骨關(guān)節(jié)炎是一類老年人高發(fā)的退行性病變,《嚴氏濟生方》中《鹿角丸》是治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典方劑,但是其傳統(tǒng)劑型服用量大,給患者帶來不便。鹿角方組成參考《鹿角丸》的處方組成,對鹿角方中的鹿角蛋白進行提取工藝優(yōu)化及酶解工藝優(yōu)化以提高鹿角蛋白口服生物利用度;通過離體外翻腸囊實驗及細胞藥效的實驗,為鹿角蛋白及鹿角方復(fù)方產(chǎn)品口服劑型開發(fā)提供藥動學(xué)實驗依據(jù)及為其在OA治療方面提供藥效研究基礎(chǔ)。方法:水為提取溶劑采用冷凝回流提取鹿角中總蛋白,以蛋白質(zhì)含量為考察指標(biāo),采取L9(34)正交試驗,對提取時間、提取次數(shù)、液料比進行考察,優(yōu)選出鹿角蛋白的提取工藝。使用市面上常見的胃蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶七種蛋白酶對鹿角蛋白進行水解作用,通過酶解物水解度及體外抗氧化活性的測定,選取合適鹿角蛋白酶解的蛋白酶。優(yōu)選出風(fēng)味蛋白酶及堿性蛋白酶進行鹿角蛋白雙酶解工藝優(yōu)化,以水解度及蛋白酶解物O_2~-·抑制率為雙目標(biāo),通過Box-Behnken試驗設(shè)計進行鹿角蛋白酶解響應(yīng)曲面優(yōu)化。建立大鼠外翻腸囊吸收模型,考察鹿角蛋白酶解前后對總氨基酸、羥脯氨酸、甘氨酸的吸收影響。通過兔膝軟骨體外培養(yǎng),建立IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞炎癥模型及H_2O_2誘導(dǎo)氧化損傷模型,評價藥物對軟骨細胞的保護作用。結(jié)果:(1)通過正交試驗優(yōu)化后,選擇鹿角蛋白終提取工藝為:提取時間為2h,提取次數(shù)為4次,料液比1:10。(2)單酶解實驗中,風(fēng)味蛋白酶酶解物水解度最高,酶解330min后水解度為33.21±9.29%;風(fēng)味蛋白酶解物·OH清除能力清除能力較強,酶解產(chǎn)物IC50為1.04 mg/m L;堿性蛋白酶酶解物O_2~-·清除效果最強,酶解產(chǎn)物IC50為1.87 mg/m L。(3)通過對鹿角雙酶解實驗結(jié)果進行擬合,得到最優(yōu)雙酶解工藝參數(shù)為酶解p H7.5,酶解溫度51.6℃,風(fēng)味蛋白酶:堿性蛋白酶比例為7:3。(4)腸吸收實驗中,酶解后的鹿角蛋白的腸吸收液中,Hyp、Gly及總氨基酸的Q120及Ka較同濃度未酶解的鹿角蛋白皆有顯著提高(P0.01)。(5)濃度為10μg/m L的酶解鹿角蛋白及鹿角方藥物都能顯著增加IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞的增殖(P0.05)。酶解鹿角蛋白及鹿角方對H_2O_2誘導(dǎo)的細胞氧化損都有很好的保護作用,能顯著提高細胞存活率(P0.01)。酶解鹿角蛋白及鹿角方藥物在100μg/m L的劑量干預(yù)下都能顯著提高(P0.05)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞內(nèi)COLⅡ的含量及細胞培養(yǎng)上清中GAG的含量。結(jié)論:(1)通過離體外翻腸囊實驗研究,鹿角蛋白經(jīng)酶解工藝后,可以大幅提高Gly、Hyp及總氨基酸在小腸部位的吸收。(2)通過離體兔膝軟骨培養(yǎng),鹿角蛋白酶解物及鹿角方都可在一定程度上改善H_2O_2及IL-1β對兔膝軟骨細胞的損傷作用。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

olin-酚法測定蛋白質(zhì)含量。取牛血清白蛋白（Bovine ser品約 30mg，精密稱定，置 100mL 量瓶中，加入少量水溶即得 0.3mg/mL 的牛血清白蛋白對照品溶液母液。精密吸溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1mL 于 25mL 具塞試管中，加水補 5mL 堿性銅溶液（10g Na2CO3，2g NaOH 和 0.25g KNaCmL 蒸餾水中為試劑 A；0.5g CuSO4·5H2O 溶解于 100mL次使用前，試劑 A 與試劑 B 以 50：1 混合，現(xiàn)配現(xiàn)用） 10min；再加入 0.5mL 福林酚試劑，搖勻，室溫下放置 白，在 650nm 處測定吸光度，以牛血清白蛋白含量（C）縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖 1-1 所示），得牛血清白蛋白=1.765C+0.031，R2=0.9993 結(jié)果表明，牛血清白蛋白在 0光度值與含量呈良好的線性關(guān)系。

圖 1-2 牛血清白蛋白顯色后吸光度隨時間的變化曲線標(biāo)回收率試驗量取適量供試品溶液 9 份于 10 mL 試管中，每份含 0.615mg入 0.304 mg/mL 的牛血清比蛋白對照品溶液 0.493，0.614，0，按 1.3 項下制備樣品，測定，結(jié)果顯示牛血清白蛋白平均加見表 1-1 所示。在高、中、低濃度下，樣品回收率都能達到圍，并且 RSD%為 1.82%，說明方法適用于樣品的檢測。表 1-1 樣品加標(biāo)回收率試驗結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品（mg）加標(biāo)后牛血清白蛋白含量（mg）回收率（%）平均值（%）平均值（%）0.4931.100 98.3997.931.086 95.68

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文白提取工藝單因素考察間對鹿角蛋白提取的影響 鹿角粉五份，按液料比 20:1 加蒸餾水，分別冷凝回流提取.5h，1h，1.5h，2h，合并提取液，以 5000r/min 的轉(zhuǎn)速離心，濾液測定提取液中總蛋白含量。由表圖 1-3 所示，隨著提取提取總量增加，當(dāng)提取時間為 0.5h 時，提取液中蛋白質(zhì)的含當(dāng)提取時間為 2h 時，提取液中蛋白質(zhì)的含量為 1833.19mg；到 2.5h 時，提取液中蛋白質(zhì)的總含量為 1797.87mg；相較 2降。這可能是長時間的高溫提取對蛋白類成分有所破壞造成
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本文編號：2869599