目的:探討尖葉假龍膽乙酸乙酯部位改善IR-HepG2細胞胰島素抵抗的作用機制,分析尖葉假龍膽乙酸乙酯部位化學成分,確保提供科學的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為中醫(yī)藥在臨床上治療糖尿病提供可靠穩(wěn)定新藥物及提升民族用藥的價值。方法:1.采用乙醇及乙酸乙酯萃取方法制備尖葉假龍膽有效部位(乙酸乙酯部位);采用高胰島素(10-6mol/L)刺激36h造模的方法,建立穩(wěn)定可靠的IR-HepG2細胞模型:采用CCK8法篩選合適的藥物濃度范圍及檢測HepG2細胞活性;以葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量;依照葡萄糖試劑盒測定葡萄糖消耗量的結(jié)果分組:正常組(Control組)、模型組(IR組)、尖葉假龍膽乙酸乙酯部位IR+50μg/mL組與IR+500 μg/mL組;采用Annexin V-FITC/PI雙染法,給藥24 h后,檢測尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對IR-HepG2細胞凋亡的影響;以酶聯(lián)免疫吸附測定法,給藥24 h后,考察尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對IR-HepG2細胞的TNF-α的影響;給藥24 h后,利用Real-time PCR 檢測 IR-HepG2 細胞胰島素信號通路 IRS1、PI3Kp85、PDK1、Akt mRNA的表達;給藥30min后,以Western-Blot法檢測IR-HepG2細胞胰島素信號通路p-InsRβTyr1 135/1136、p-IRS1 ser307、p-PDK1 ser241、p-AktThr308 蛋白磷酸化水平的表達及PI3Kp85蛋白水平。2.采用高分辨液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析尖葉假龍膽乙酸乙酯部位化學成分;并通過HPLC-DAD高效液相色譜法,建立了同時測定尖葉假龍膽乙酸乙酯部位中去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮含量的方法,可為多指標成分測定質(zhì)量控制提供參考。結(jié)果:1.篩選得到最佳模型條件:胰島素濃度為10-6mol/L時,培養(yǎng)36h后,IR效果最佳,維持時間48 h;細胞毒性實驗表明:尖葉假龍膽乙酸乙酯部位濃度為500μg/mL及低于此濃度時,細胞存活率達到實驗要求;尖葉假龍膽乙酸乙酯部位濃度為500、250、100、50 μg/mL時,對IR-HepG2細胞模型有不同的程度促進葡萄糖消耗作用(P0.01),隨著藥物濃度的增大,降糖效果越好,藥物濃度為500 μg/mL降糖效果與鹽酸二甲雙胍相當,濃度為10μg/mL時,未見其促進細胞葡萄糖消耗(P0.05);尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對IR-HepG2細胞凋亡無影響;Elisa結(jié)果表明:與IR組相比,IR+50μg/mL組和IR+500 μg/mL組TNF-α表達水平呈現(xiàn)劑量依賴方式下降(P0.01),由此說明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位能夠下調(diào)TNF-α的水平;分子生物學實驗表明:與IR 組相比,IR+50μg/mL 組和 IR+500 μg/mL 組均能上調(diào) IRS1、PI3Kp85、PDK1、Akt mRNA的表達(P0.01或P0.05);與IR組相比,IR+50 μg/mL組和IR+500 μg/mL組均能上調(diào)p-InsRβ Tyr1135/1136、p-PDK1 ser241、p-Akt Thr308蛋白磷酸化水平(P0.01),下調(diào)p-IRS1 ser307蛋白磷酸化水平(P0.01),上調(diào)PI3Kp85蛋白水平(P0.05)。2.結(jié)合文獻及對照品對照,共指認出尖葉假龍膽乙酸乙酯部位9個化合物,包括(?)酮類化合物4個(1,6-二四羥基-3,4-二甲氧基(?)酮、去甲基雛菊葉龍膽酮、swertiabisxanthone-I、雛菊葉龍膽酮),(?)酮苷類化合物3個(去甲基當藥苷、當藥醇苷、5,8-二羥基-1,4-二甲氧基(?)酮-3-O-β-D-葡萄糖苷),黃酮苷類化合物1個(異葒草素),三萜類化合物1個(齊墩果酸);建立了尖葉假龍膽乙酸乙酯部位同時測定去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮含量的方法,其含量分為 103.93 mg/g～106.33 mg/g 和 374.45 mg/g～379.22 mg/g。結(jié)論:尖葉假龍膽乙酸乙酯部位明顯改善IR-HepG2細胞糖代謝及IR,促進糖消耗。其機制可能與調(diào)節(jié)胰島素IRS/PI3K/Akt信號通路中的IRS1、PI3Kp85、PDK1、Akt基因表達,p-InsRβ Tyr1 135/1136、p-PDK1 ser241、p-Akt Thr308 蛋白磷酸化水平及 PI3Kp85蛋白水平相關(guān)。下調(diào)細胞因子TNF-α表達水平的作用,也可能是作用機制之一。尖葉假龍膽乙酸乙酯部位主要含有(?)酮及其苷類化合物,建立了同時測定兩種成分含量測定的方法,對其主要成分含量進行測定。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285;R284
【部分圖文】：

ｑ＞Ｇ２細胞模型的建立??驗結(jié)果表明，如圖１－３所示，在不同濃度（１０＿９、１（Ｔ８、】０＇］０＇?ｌ（Ｔ５ｍｏｌ／激２４ｈ后，胰島素濃度為１（Ｔ９、１（Ｔ７ｍｏｌ／Ｌ與Ｃｏｎｔｒｏｌ組相比，差異具有＜０．０。ＫＴ８、１０ｌＴ５ｍｏ

?尖葉假龍膽乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗作用機制研究及成分分析出，細胞總凋亡率在給藥組與模型組及正常組之間沒有顯著性差異（Ｐ＞〇．〇５）。所以出，ＩＲ－ＨｅｐＧ２細胞用含尖葉假龍膽乙酸乙酯部位的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，其對細胞無凋亡用。???Ｉ?ｔ?Ｉ???ＺＵ?Ｉ?Ｕ?Ｉ?Ｚ?Ｉ?Ｚ＇ｌｌｉｕｕｅｉ??

－，。??終止溶液５０＾Ｌ按照順序加到每孔內(nèi)，用于終止反應(yīng)。??）用酶標儀在５?ｍｉｎ內(nèi)，用４５０?ｎｍ波長按照號碼測量各孔的ＯＤ值。??析方法??分析利用ＳＡＳ?８．２統(tǒng)計學軟件進行分析，方差齊，兩組間比較采用ＬＳ，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗；多組比較采用單因素方差分析，尸＜０．義，Ｐ＜０．０１有極顯著統(tǒng)計學意義，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）龍膽乙酸乙酯部位對ＩＲ－ＨｅｐＧ２細胞ＴＮＦ－ｏｔ的影響??１－９所示，與Ｃｏｎｔｒｏｌ組相比，ＩＲ組有較高水平的ＴＮＦ－ａ，差異具有（／＾Ｏ．Ｏｌ）；表明ＨｅｐＧ２細胞在高胰島素刺激下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。與ＩＲｍＬ組和ＩＲ＋５０〇ｎｇ／ｍＬ組ＴＮＦ－ａ表達水平呈現(xiàn)劑量依賴方式下降，差學意義（尸＜〇．〇１）；由此說明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位能夠下調(diào)ＴＮＦ－１５０－??
【參考文獻】

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本文編號：2868997