目的:化橘紅來(lái)源于蕓香科柑橘屬植物化州柚(Citrus maxima‘Tomentosa’)或柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.)及其栽培變種的未成熟或近成熟干燥外層果皮�；偌t具有化痰止咳、理氣消積等功效,用治風(fēng)寒咳嗽、久咳哮喘、嘔吐呃逆等癥。化橘紅是我國(guó)長(zhǎng)久以來(lái)用藥篩選出的優(yōu)質(zhì)藥品,是廣東十大南藥之一。其中來(lái)源于化州柚的毛橘紅是傳統(tǒng)的道地藥材,在廣東地區(qū)享有很高的聲譽(yù)。毛橘紅與來(lái)源于其它雜柚的光橘紅市場(chǎng)價(jià)格差異極大,市場(chǎng)上的化橘紅藥材多來(lái)源于光橘紅。而化橘紅基原植物來(lái)源復(fù)雜異常,區(qū)分十分困難。傳統(tǒng)的鑒別手段往往受限于植物生長(zhǎng)年限、部位、環(huán)境等諸多因素,而分子標(biāo)記的方法是基于植物內(nèi)在遺傳物質(zhì)的差異進(jìn)行鑒別,不易受這些因素的影響,且其結(jié)果較為可靠客觀、準(zhǔn)確。因此,采用分子標(biāo)記手段對(duì)化州柚及其近緣品系植物進(jìn)行研究,能夠探討不同品系的化州柚遺傳背景以及與其它柚類的親緣關(guān)系;有利于開(kāi)發(fā)一種快速有效的鑒別方法,可以從苗期區(qū)分兩者,為穩(wěn)定苗木市場(chǎng)提供一種有力手段,同時(shí)也能為規(guī)范化橘紅藥材市場(chǎng)奠定一些基礎(chǔ)。方法:本研究采用ITS2、psb A-trnH、matK三段DNA條形碼序列在基因序列水平上對(duì)化州柚及其近緣品系共26份樣品DNA進(jìn)行研究,尋找合適于柚類植物分析的DNA條形碼序列。利用SCoT標(biāo)記和SRAP標(biāo)記對(duì)26份試材DNA進(jìn)行遺傳聚類分析研究,并結(jié)合兩者對(duì)比分析,對(duì)比多種分子標(biāo)記手段在化州柚及其近緣品系植物研究中的效果。在SCoT標(biāo)記和SRAP標(biāo)記的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)快速、直觀的SCAR標(biāo)記進(jìn)行鑒別分析,以期為化橘紅基原植物的鑒別提供一種快速、高效的鑒定方法。結(jié)果:1.應(yīng)用3條國(guó)際通用DNA條形碼對(duì)化州柚及其近緣品系進(jìn)行研究,其中matK序列僅在外類群樣品中得到1個(gè)堿基的變異,無(wú)法進(jìn)行后續(xù)遺傳聚類分析。ITS2序列雖然得到較高的變異率但聚類結(jié)果不理想,而psb A-trnH序列變異率較ITS2低,但取得的聚類結(jié)果更接近于真實(shí)情況,結(jié)合兩種標(biāo)記的分析結(jié)果則未優(yōu)于psbA-trnH的聚類結(jié)果。但在總體上,DNA條形碼序列在種下水平尤其是柚類植物的研究中,難以取得較好的效果。2.采用正交設(shè)計(jì)結(jié)合單因素法對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,得到最終的優(yōu)化結(jié)果為:3 mmol/L Mg~(2+)、0.3mmol/L dNTPs、0.75UTaq酶、0.6μmol/L引物、40ngDNA。通過(guò)引物篩選及退火溫度優(yōu)化,從36條引物中篩選出6條引物,在26份樣品中擴(kuò)增出了94條條帶,平均多態(tài)性73.4%。利用UPGMA算法構(gòu)建聚類樹(shù),對(duì)化州柚及其近緣品系進(jìn)行分類鑒別研究。3.應(yīng)用正交設(shè)計(jì)結(jié)合單因素法對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化,得到的最佳條件為:3 mmol/L Mg~(2+)、0.25 mmol/L dNTPs、0.75UTaq酶、0.4μmol/L每引物、40ngDNA。通過(guò)對(duì)110對(duì)引物組合的篩選,最終得到7對(duì)引物組合對(duì)所有樣品進(jìn)行分析,共擴(kuò)增出84條條帶,平均多態(tài)比率70.24%。其構(gòu)建的聚類樹(shù)與SCoT相似,但結(jié)果更為準(zhǔn)確,結(jié)合兩者標(biāo)記構(gòu)建聚類樹(shù),發(fā)現(xiàn)與SRAP構(gòu)建的聚類樹(shù)大致相同,但更為準(zhǔn)確,表明SCoT標(biāo)記和SRAP標(biāo)記是適用于化州柚及其近緣品系植物分析的方法。對(duì)比SCoT、SRAP標(biāo)記及兩者結(jié)合的結(jié)果,mantel分析顯示三種標(biāo)記兩兩間的相似度高,表明SCoT標(biāo)記和SRAP標(biāo)記能夠有效結(jié)合,其結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。4.在SCoT標(biāo)記和SRAP標(biāo)記的研究中發(fā)現(xiàn)3條特異性條帶,對(duì)這3條條帶進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序,獲得3條條帶的序列。對(duì)其重新設(shè)計(jì)引物,嘗試轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記,最終在SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)所有樣品均出現(xiàn)了1條均一的條帶,表明SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化失敗。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn),總結(jié)了幾條可能導(dǎo)致失敗的原因,以期為后來(lái)SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。結(jié)論:3條國(guó)際通用DNA條形碼序列在化州柚及其近緣品系的遺傳關(guān)系研究中,未取得理想的效果,僅psbA-trn H序列的建樹(shù)結(jié)果較好。SCoT標(biāo)記的擴(kuò)增效率和多態(tài)性較SRAP標(biāo)記高,但在聚類分析中,SRAP標(biāo)記取得了更接近真實(shí)情況的效果,結(jié)合兩種標(biāo)記分析,發(fā)現(xiàn)其能夠完全區(qū)分化州柚及其它柚類。在基于SCoT標(biāo)記和SRAP標(biāo)記的基礎(chǔ)上,開(kāi)發(fā)SCAR標(biāo)記,獲得了3段特異序列,對(duì)其設(shè)計(jì)專有引物,但在最后驗(yàn)證的時(shí)候發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性消失,轉(zhuǎn)化失敗。筆者根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并參考了一些文獻(xiàn),總結(jié)了幾點(diǎn)可能導(dǎo)致SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化失敗的原因,以期為后人的研究提供一些參考和借鑒。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R282.5
【部分圖文】：

圖 1 26 份樣品總 DNA 提取結(jié)果注：M：Marker 泳道 1-26 對(duì)應(yīng) A1-A262.3.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖 2-4，26 份樣品的 matK、ITS2、psbA-trnH 序列均擴(kuò)增得到單一明亮的

ITS2序列擴(kuò)增圖

psbA-trnH序列擴(kuò)增圖
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姜波;鐘云;吳波;李菊;鐘廣炎;曾繼吾;;利用SNP分子標(biāo)記分析鑒定不同形態(tài)的化橘紅(Citrus grandis var.tomentosa)單株[J];果樹(shù)學(xué)報(bào);2015年06期

2 廖弈秋;李泮霖;廖文波;蘇薇薇;;南藥化橘紅基原考證[J];中藥材;2015年02期

3 陳凌華;洪自同;程祖鋅;謝寶貴;鄭金貴;;赤芝菌株的SCAR標(biāo)記鑒別[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2014年06期

4 林旗華;林燕金;盧新坤;;利用SRAP分子標(biāo)記及果肉汁胞色素分析鑒定柚子新品種黃金蜜柚[J];分子植物育種;2014年06期

5 羅昭標(biāo);陳歡;王廣超;熊書斌;占俊文;;SCAR標(biāo)記及其在特色優(yōu)質(zhì)煙葉研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2014年07期

6 王榮梅;李啟艷;謝強(qiáng)勝;;市售化橘紅質(zhì)量評(píng)價(jià)[J];藥物分析雜志;2014年04期

7 彭維;蘇薇薇;古淑儀;王永剛;郭靜;;原創(chuàng)中藥新藥紅珠膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年06期

8 姜小鳳;高燕會(huì);童再康;黃春紅;;石蒜屬植物SCoT-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建及優(yōu)化[J];浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào);2013年03期

9 郭麗英;郭雁君;吉前華;何新華;黃桂香;陳虎;;扁柑種質(zhì)資源的SCoT分析[J];西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2013年02期

10 許洹瑞;;分子標(biāo)記技術(shù)及其研究進(jìn)展[J];黑龍江環(huán)境通報(bào);2013年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 韓國(guó)輝;基于EST-SSR、Genomic-SSR和SCoT標(biāo)記的柑橘連鎖圖譜構(gòu)建及雜種和多倍體遺傳分析[D];西南大學(xué);2012年

2 于杰;柑橘及其近緣屬植物DNA條形碼研制及其物種的鑒定研究[D];西南大學(xué);2011年

3 羅焜;基于蕓香科、天南星科的植物DNA條形碼通用序列研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 王劍鍇;金線蓮RAPD-SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和不同種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

2 龐一波;化州橘紅種質(zhì)資源的分子評(píng)價(jià)及其類黃酮主要成分含量的分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 蔣巧巧;應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定湖南甜橙變異株系的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 楊迎花;利用SRAP標(biāo)記對(duì)湖南柚資源遺傳多樣性的分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

5 賀熙勇;澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[D];西南大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2868752