諸葛菜種子化學(xué)成分及生物活性研究

發(fā)布時間：2020-11-03 07:49

　　諸葛菜(Orychophragmus violaceus(L.)O.E.Schulz)是十字花科(Brassicaceae)諸葛菜屬植物,一年生或越年生草本植物,主要分布在亞洲中部及東部,在我國分布廣泛,別名二月蘭。國內(nèi)外對諸葛菜已有的研究報道表明,其植物中化合物種類主要包括黃酮類、酚酸類、三萜皂苷等,作為一個歷史悠久的民間用藥,具有抑制腫瘤、抗菌消炎、保護(hù)肝臟等生理活性。本課題組前期試驗以人肝癌HepG2細(xì)胞株為體外抗腫瘤模型進(jìn)行抗腫瘤試驗,采用MTT法,發(fā)現(xiàn)諸葛菜種子總提取物有良好的抗腫瘤活性。本文在綜述了十字花科近五年植物化學(xué)成分及生物活性研究的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)研究了諸葛菜種子的化學(xué)成分,對分離純化得到的部分化合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性評價,并對新骨架化合物進(jìn)行了體外抗輻射試驗。將40 kg諸葛菜干燥種子,以240 kg 70%乙醇回流提取,重復(fù)提取3次,每次提取時間2 h,合并提取液,濃縮后得到總浸膏,浸膏經(jīng)石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,得到各萃取部位,分別對各萃取部位進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化。本實(shí)驗采用硅膠柱色譜、AB-8大孔吸附樹脂柱色譜、SephadexLH-20凝膠柱色譜、ODS柱色譜和制備HPLC等技術(shù)方法,得到了 71個化合物,通過化合物的理化性質(zhì)及質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振譜等方法,共鑒定了其中53個化合物的結(jié)構(gòu)。鑒定的化合物包括10個新化合物,分別為:諸葛菜堿A(1),諸葛菜堿B(2),諸葛菜堿C(3),諸葛菜素A(4),諸葛菜素B(5),諸葛菜素C(6),諸葛菜素D(7),諸葛菜龍腦苷A(8),諸葛菜皂苷A(9),諸葛菜苷B(10),其中化合物1-3為新骨架類型的生物堿,化合物4-7為四個異香豆素類化合物,化合物8為單萜苷,化合物9為二萜苷,化合物10為三萜皂苷;已知化合物43個,分別為甜葉懸鉤子苷(11),密蒙花苷 C(12),3-O-α-L-鼠李糖-(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→3)-[β-D-葡萄糖-(1→2)]-β-D-巖藻糖-23,28-二羥基柴胡皂苷-11,13(18)-二烯(13),3β-O-(β-D-木糖-(1→2)-[β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→3)]-β-D-巖藻糖-23,28-二羥基柴胡皂苷-11,13(18)-二烯(14),密蒙花苷D(15),密蒙花苷E(16),密蒙花苷F(17),醉魚草皂苷Ⅰ(18),醉魚草皂苷Ⅲ(19),醉魚草皂苷Ⅰa(20),醉魚草皂苷Ⅲa(21),苯甲酸(22),2-羥基苯甲酸(23),4-羥基苯甲酸(24),4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(25),3,4,5-三甲氧基苯甲酸(26),7-羥基-6-甲氧基香豆素(27),5,7-二羥基色原酮(28),7,8-二甲基吡嗪(29),芫花素(30),蒙花苷(31),異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(32),芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(33),金圣草黃素-7-O-β-D-葡萄糖苷(34),金合歡素-7-O-β-D-葡萄糖苷(35),染料木素(36),5,7,3',5'-四羥基二氫黃酮(37),5,7,3',5'-四羥基-二氫黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(38),香橙素-7-O-β-D-葡萄糖苷(39),橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(40),1,3-二羥基蒽醌(41),落葉松樹脂醇(42),落葉松樹脂醇-9-O-β-D-吡喃型葡萄糖苷(43),異落葉松樹脂醇-9-O-β-D-吡喃型葡萄糖苷(44),正十六烷酸(45),正二十一烷酸(46),薯蕷皂苷(47),纖細(xì)薯蕷皂苷(48),β-谷甾醇(49),胡蘿卜苷(50),β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷-20-0-棕櫚酸酯(51),白桂木內(nèi)酯B(52),長壽花葡萄糖苷(53)。除化合物22、37及50外,其余化合物均為首次從諸葛菜屬中分離得到。從諸葛菜種子中分離得到一系列2-哌嗪酮駢合2,4-二羰基-1,3,5-三嗪結(jié)構(gòu)類型的生物堿,這是自然界中首次發(fā)現(xiàn)的新骨架類型。此外還有新的異香豆素、黃酮、三萜皂苷類化合物等,極大地豐富了該屬植物的化學(xué)成分,為諸葛菜植物化學(xué)成分研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。采用MTT法,對分離得到的部分化合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性評價。以人肝癌HepG2細(xì)胞株、人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株和人肺腺癌A549細(xì)胞株為腫瘤模型,對分離得到的生物堿類新化合物1-3進(jìn)行體外活性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長,對人肝癌HepG2細(xì)胞株、人肺腺癌A549細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株和人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞株的抑制效果非常明顯,其IC50值分別為7.73,10.79,11.91和9.93μM;以人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞株和人宮頸癌Hela細(xì)胞株為腫瘤模型,對分離得到的異香豆素類新化合物4-7進(jìn)行體外活性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物4顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長,對人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞株和人宮頸癌Hela細(xì)胞株的抑制效果非常明顯,其IC50值分別為5.10和8.91 μM,化合物5和6的IC50值在10.12到28.30 μM之間;對化合物4進(jìn)行了初步的抗腫瘤活性機(jī)理研究,即通過流式細(xì)胞儀檢測化合物4對HCT-116細(xì)胞周期和DNA含量的變化的影響,通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測化合物4對HCT-116細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,隨著藥物濃度的升高,化合物4將HCT-116細(xì)胞周期阻滯在G2期,并顯著增加了細(xì)胞凋亡,其細(xì)胞毒作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的。以人肝癌HepG2細(xì)胞株和人肺腺癌A549細(xì)胞株為腫瘤模型,對分離得到的三萜皂苷類化合物9-21進(jìn)行體外活性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物9,12,15,18,19顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長,化合物18和19的IC50值在0.48到1.06 μM之間,新化合物9的IC50值分別為7.13和8.77 μM。另外,對化合物1-3進(jìn)行體外抗輻射篩選,采用60Coγ輻照的人臍帶靜脈上皮細(xì)胞株(HUVEC)為模型,結(jié)果表明,當(dāng)濃度為10 μM時,化合物3將輻射后HUVEC 細(xì)胞株的存活率從(56.71 ± 0.92)%提升到(77.64 ± 1.19)%(P0.01,GraphPad Prism 5)。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284.1;R285
【部分圖文】：

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