目的探討淫羊藿總黃酮(total flavones of epimedium,TFE)調(diào)控miR-34a-5p保護(hù)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。方法建立LPS誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞模型,給予TFE含藥血清,MTT法檢測成骨細(xì)胞活性。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因,檢測熒光活性,脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34a-5p模擬物和抑制劑。RT-PCR分析轉(zhuǎn)染前后miR-34a-5p、SMAD2、ALP、RUNX2mRNA的表達(dá),Western blot檢測SMAD2、RUNX2、ALP蛋白表達(dá)。結(jié)果 TFE能提高LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活性,促進(jìn)RUNX2、ALP蛋白表達(dá)(P0.01)。TFE在LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中可促進(jìn)miR-34a-5p的表達(dá),抑制SMAD2的mRNA及蛋白表達(dá)水平。miR-34a-5p轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,顯著降低熒光素酶報(bào)告基因的活性,促進(jìn)成骨細(xì)胞RUNX2、ALP的蛋白表達(dá)。抑制miR-34a-5p可促進(jìn)成骨細(xì)胞SMAD2mRNA及蛋白表達(dá),并抑制成骨因子的表達(dá)(P0.05),逆轉(zhuǎn)了TFE對LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)論 TFE通過調(diào)控miR-34a-5p與SMAD2相互作用,減輕LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷。
【文章目錄】：
1 材料
    1.1 實(shí)驗(yàn)動物
    1.2 藥物與試劑
    1.3 主要儀器
2 方法
    2.1 TFE及含藥血清制備
    2.2 原代成骨細(xì)胞的制備及分組
    2.3 MTT法測定細(xì)胞活性
    2.4 成骨細(xì)胞堿性磷酸酶合成及鈣沉積的測定
    2.5 ELISA法檢測炎性因子表達(dá)的影響
    2.6 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建和熒光素酶活性分析
    2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
    2.8 RT-PCR檢測成骨細(xì)胞各組轉(zhuǎn)染前后RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA表達(dá)水平
    2.9 Western blot檢測成骨細(xì)胞各組轉(zhuǎn)染前后SMAD2、ALP、RUNX2蛋白的表達(dá)
    2. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
3 結(jié)果
    3.1 MTT檢測成骨細(xì)胞增殖率的比較
    3.2 ELISA檢測大鼠成骨細(xì)胞中IL-6、TNF-a、OC、堿性磷酸酶含量、鈣結(jié)節(jié)表達(dá)水平
    3.3 TFE對LPS誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響
    3.4 miR-34a-5p對SMAD2表達(dá)的靶向調(diào)控作用
    3.5 過表達(dá)miR-34a-5p對LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響
    3.6 抑制miR-34a-5p對LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響
4 討論

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